在小鼠胚胎干细胞结构功能研究使用重组酶介导的盒式交换

这种结构-功能方法的总体目标是在分子水平上剖析不同蛋白质结构域或疾病相关突变在幼稚或分化的小鼠胚胎干细胞中的作用。这种方法可以帮助揭示蛋白质的不同残基或结构域如何在给定的细胞环境中促进其功能。该技术的主要优点是，它允许非常有效地将拯救构建体靶向敲除胚胎干细胞或 ES 细胞的基因组，并研究它们在不同细胞类型中的作用。

为了实现这一目标，我们结合了三种高效的技术。这些应用包括改进的小鼠胚胎干细胞分离、基于重组的靶向因子组装以及通过重组介导的盒交换 （RMC） 靶向 ES 细胞。演示一些程序的是我实验室的技术人员 Jinke D'Hont。

重组介导的盒交换 （RMCE） 允许在载体和基因组位点之间交换 DNA 片段。RMCE 利用了不发生交叉反应且嵌入基因组位点的异质特异性重组位点。在供体质粒存在的情况下，该供体质粒的 DNA 片段两侧具有相同的异质特异性位点，由于双重同时易位，重组酶会将该 DNA 片段插入到 RMCE 兼容的基因组位点中。

只有在正确重组后，Rosa 26 停靠位点中被捕获的无启动子新霉素抗性基因才会通过传入靶向载体中的 PGK 启动子恢复，从而产生耐药性。这种新霉素抗性捕获系统导致非常高的靶向效率，通常接近 100%在囊胚分离前一天，向 12 个培养良好的板中加入 0.1% 明胶。并将它们在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。

吸出明胶溶液。然后将四分之一的小瓶 P2 小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 接种到 MEF 培养基中，并在 12 孔板上分装。将 MEF 的 12 孔板在 2 毫升 MEF 培养基中于 37 摄氏度孵育。

并将细胞生长成汇合的单层。然后向孔中加入每毫升 10 微克的丝裂霉素种子。并将培养物在 37 摄氏度下孵育 3 小时，以灭活细胞。

根据文本方案在 Rosa 26 基因座中选择含有 RMCE 盒的杂合敲除小鼠后，设置交配以培育 RMCE 兼容的杂合敲除小鼠，与杂合敲除小鼠。第二天早上，通过用故事的底部抬起雌性来检查交配栓，并检查阴道口是否有白色肿块。如果塞子难以看到，请用倾斜的探针，稍微张开外阴的嘴唇，然后将堵塞的雌性与雄性分开。

在后 3.5 天或 DPC 收集囊胚。对怀孕的雌性实施安乐死后，在腹中部切开一个，用细剪刀和镊子解剖子宫和输卵管。接下来，将 26 号针头弯曲成 45 度角，该针头连接到装满 M2 培养基的 1 毫升注射器上。

并将针头插入最靠近输卵管的子宫末端。使用细镊子将针头固定到位，同时推动柱塞，将囊胚从子宫冲洗到 10 厘米培养皿的盖子中。如果冲洗成功，子宫会肿胀。

使用口腔移液器将所有胚胎收集在一滴 M2 培养基中，并在一滴 M2 培养基中洗涤胚胎两次。洗涤胚胎后，立即使用 PBS 洗涤丝裂霉素-C 灭活细胞两次。然后使用口腔移液器，将每个囊胚接种到丝裂霉素-C 处理的 MEF 的单独孔中，在补充有多能或 2I 的 SRES 细胞培养基中。

在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育培养物。每两到三天刷新一次 SREF 细胞培养基。在立体显微镜下以 4 倍放大倍率检查每个囊胚，并检查孵化和脱离到 MEF 层。

培养 10 至 12 天后，在立体显微镜下，使用带有一次性吸头的 P10 移液器挑选单个 icium 生长物。将每个生长物转移到大约 10 微升的培养基中，转移到 V 形 96 孔板中，每孔含有 30 微升 PBS。使用多通道移液器，向每个孔中加入 50 微升 0.25% 胰蛋白酶。

并将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 3 分钟。加入 100 μL 预孵育的含 FPS 的 ES 细胞培养基，并通过移液 10 至 15 次将 icium 生长物解离成单个细胞。然后将解离的细胞转移到丝裂霉素-C 处理的 96 孔 MEF 板中。

第二天，更改基于 SR 的介质。以类似的方式将 ES 细胞从 24 孔板扩展到 6 孔板。根据文本方案鉴定拯救的 CDNA 载体后，使用 100 ng 拯救 CDNA 载体、150 ng 预切除的 RMCEDV1 载体和 2 μL 重组酶混合物制备 10 μL LR 反应，其中包含噬菌体编码的整合酶、切除酶和细菌整合宿主因子。

在 25 摄氏度下孵育反应 2 小时。为了转化重组载体，在 2 毫升裙边螺旋盖管中加入 5 微升每种混合物到 40 微升热休克感受态大肠杆菌中。并将样品在冰上孵育 20 分钟。

然后将细胞在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。向试管中加入 1 毫升 LB 培养基，并在 37 摄氏度下孵育细胞 1 小时。在含有氨苄青霉素的琼脂平板上铺板 50 微升。

并在 37 摄氏度下过夜生长。通过使用 P200 探针随机挑选 5 个克隆，识别具有正确靶向载体的克隆。将吸头转移到含有 2 至 5 ml LB 培养基的玻璃试管中，并在 37 摄氏度下生长过夜。

从每个菌落中提取 DNA 后，通过消化 0.5 至 2 μg DNA 来验证样品，并在 1% 琼脂糖凝胶上分离样品。开始培养 RMCE 兼容的基因敲除 ES 细胞，并在基于 FBS 的 ES 细胞培养基中，在 MEF 上至少传代两次。然后在糊化的六孔板上分裂 ES 细胞。

第二天，使用 1.5 毫升基于 FBS 的 ES 细胞培养基刷新汇合度约为 50% 的 ES 细胞。将 1 μg 预切除的 RMCEDV1 靶向载体（含有拯救 CDNA）和 1 μg FLIPe 表达质粒混合在 250 μL 纯 DMEM 培养基中。将 7 μL 基于 lipofectin 的横流试剂添加到 250 μL 纯 DMEM 培养基中。

并在室温下孵育溶液 5 分钟。混合 DNA 和 lipofectin 溶液。并将混合物在室温下孵育 20 分钟。

然后将移液管混合物移液到刷新的 ES 细胞上，轻轻旋转。横平后 1 天，将所有 ES 细胞从试管中分离到 10 厘米的培养皿中，该培养皿具有 DR4 MEFS 汇合层和 10 毫升基于 FPS 的 ES 细胞培养基。横平后 2 天，通过向培养基中加入 G418 来选择具有正确 FLIP-e 介导的盒交换的 ES 细胞克隆。

如图所示，非靶向菌落的大量杀伤应在 3 到 5 天后可见。菌落应在 7 到 10 天后出现。挑选这些菌落，然后扩增它们，并验证克隆，如本视频前面所示。

为了将 ES 细胞分化为胚状体或 EB，在根据文本方案用 Rosa 26 驱动的拯救构建体培养敲除的 ES 细胞后，允许 EB 在非贴壁培养皿中形成 30 天。将 EB 悬浮液转移到 50 毫升试管中，每 2 到 3 天刷新一次培养基。并让 EB 在重力作用下沉降。

去除上清液，加入新鲜培养基，然后将 EB 悬浮液转移到细菌级培养皿中。根据文本方案，通过免疫荧光和 TEM 分析 ES 细胞和 EB。使用结构函数方法，以 100% 的效率生成了 5 个预先切除的 RMCEDV1 靶向载体，并通过 RMCE 靶向这些拯救构建体，以 97% 的 P120 连环蛋白敲除 ES 细胞，效率为 97%囊性 EB 形态可用作表型读数来筛选不同的拯救构建体。

作为概念验证，R26 驱动的 P120 catenin 亚型 1A 挽救了 p120 catenin 敲除表型。为了测试 P120 连环蛋白的 E-钙粘蛋白非依赖性膜锚定是否能够形成 cytic EB，将 k-ras 膜靶向基序 CAAX 融合到 P120 连环蛋白的羧基末端，并通过 RMCE 引入 P120 连环蛋白敲除 ES 细胞，然后再从它们制造 EB。然而，这种构建体是一种显性阴性，不允许 E-钙粘蛋白的结合和稳定。

因此，并不能挽救 p120 catenin 敲除表型。上皮-间充质转化 （EMT） 是一个重要的发育过程，也发生在 ES 细胞分化过程中。当在 p120 连环蛋白敲除 ES 细胞中表达时，可以直接抑制各种上皮标志基因（如 E-钙粘蛋白）的 EMT 诱导剂 ZEB1、ZEB2 或蜗牛未能恢复囊性 EB 形成。

一旦掌握，可以在 1 个月内分离出兼容 RMCE 的 ES 细胞。可以在一周内生成兼容 RMCE 的靶向载体，如果执行得当，使用该技术可以在一个月内实现 ES 细胞的靶向挽救。观看此视频后，您应该对如何使用 RMCE 在幼稚或分化的胚胎干细胞中进行结构功能研究有很好的了解。