反向遗传吗啉使用方法心脏心室射出转染多难靶组织中的斑马鱼幼虫

一个适应性强的反向遗传学方法，斑马鱼在后来的发展和生理平衡，如使用基因特异性吗啉脑室注射组织再生的阶段来评估基因的功能。

该程序的总体目标是通过脑室注射到幼虫、鳍和敲低基因中递送 morph eno 寡核苷酸，以评估它们在再生过程中的功能。这是通过首先麻醉幼虫并将它们放入 aros 模具的凹槽中来实现的。接下来，将注射针插入心室。

然后将吗啡溶液注射到心室中 4 到 6 次，脉冲之间的加权间隔以允许清除心脏。最后，鳍被截肢并让其再生三天。最终，可以通过使用 Fiji Image J 开源软件的线跟踪工具测量鳍的再生面积来评估对鳍再生的影响。

与现有方法（如转基因或诱变）相比，该技术的主要优点是它允许在不适合直接注射的幼虫组织中通过 minos 敲除基因使用直径为 0.75 毫米的玻璃毛细管，将一个放入针头拉出器中，然后用制表师镊子按以下参数拉针， 在带有千分尺目镜的立体镜下，打破拉出的毛细管以产生直径为 20 微米的针头。然后使用带有粘合橡胶旋车轮的车床磨针并产生 20 微米的斜面。通过将冻干的 Morpho 溶解在一个 XPBS 中至终浓度为 7.5 毫摩尔来制备 morpho 原液。

通过将 2.5 微升 Morpho 储备溶液与 2.8 微升 1 毫摩尔 endo Porter 储备溶液混合，最终浓度为 3.5 毫摩尔形态和 0.5 毫摩尔 endo Porter 进行注射。使用带有 10 微升尖端的微量移液器，在斜面玻璃针头中加入 5 微升 morpho 溶液。然后将玻璃针插入连接到气动 pico 泵的微型机械手的持针器中。

将注射角度调整到大约 45 度，以便只需将针头沿一个刨床方向移动。接下来，按如下方式设置微型喷油器值，A 保持压力为 20 磅/平方英寸或 PSI，喷射压力为 15 PSIA，100 毫秒的门控范围和周期值为 1.9，对应于 10.9 毫秒。在一个 XPBS 中准备 20 毫升融化的 1.5%aros，然后将其倒入 10 厘米的培养皿中。

然后将带槽的注射模具放入温暖的 aros 中，在硬化的凝胶中形成沟壑以麻醉幼虫。将它们放入 100 毫升水族箱水中，每升 trican 含 20 毫克。在它们停止对触摸做出反应后，使用塑料牧移管小心地将幼虫转移到湿 aros 霉菌的凹槽中，使腹侧面向凹槽的垂直 aros 壁。

将 aros 板放在立体显微镜下，使心室背对注射针。接下来，放下针头并将其插入心室约 1 到 2 微米。注意不要插入太深。

然后将 3 纳升脉冲的 Morpho 溶液注入心室并称重以清除心脏，然后在注射后再重复 5 次脉冲，取出针头并将其放入含有一个 XPBS 的培养皿中以防止干燥。然后，使用装满 E 3 培养基的移液管小心地将幼虫转移回含有新鲜 E 3 培养基的培养皿中，以确保细胞中形态的吸收和维持。在实验期间每 12 到 24 小时重复注射一次，以评估注射情况。

麻醉鱼后，将它们放在覆盖有 E 3 培养基的平坦湿 aros 板上，然后使用具有明场和荧光的立体显微镜对它们进行成像。使用 Fiji Image J 免费软件分析图像以进行再生，以使用线跟踪工具来确定已发生的再生生长量。首先，通过将文件拖放到主菜单中的斐济主窗口中来校准图像。

通过单击下拉菜单中的 analyze 来设置所有图像的比例。单击 set scale （设置比例），然后通过单击复选框打开 global 选项。现在再次拖放图像以测量工具栏中的再生生长量。

选择手绘选择工具并圈出要测量的区域。最后，按 Ctrl M.这将打开一个新的结果窗口，以方形像素显示包围区域的值。如图所示，在注射后几分钟内，morpho endo porter 溶液会分布到整个脉管系统的不同组织中，例如鳍褶皱和大脑，持续至少 12 小时或更长时间。

为了评估远端幼虫鳍结构的再生，去除了以下内容，鳍皱襞和脊髓的远端尖端，远端无脊髓，远端躯干肌肉，在这里不可见，以及色素细胞，它们很难通过直接注射靶向，但在连续脑室注射后似乎融入了形态。因此，这种方法相对容易地促进将 morpho 递送到难以单独靶向的组织，并且它允许同时评估再生鳍中多个组织中的基因功能。为了分析参与再生的特定基因的重要性，将幼虫鳍部分截肢，并切除所有已掺入形态的组织。

如图所示，幼虫鳍褶皱在截肢后几天内再生其结构。在这里，morpho 靶向再生所需的基因，与 unin 注射和错配 morpho 对照相比扰乱了再生反应 morpho 控制在其发育后。这项技术为再生领域的研究人员探索参与斑马鱼鳍再生的分子机制铺平了道路。