利用心脏心室注射反向遗传学吗啉代寡核苷酸方法转染斑马鱼幼鱼中多个难以靶向的组织

本实验的总体目标是通过心室注射将吗啉代寡核苷酸递送至幼体斑马鱼体内，以敲低特定基因并评估其在再生过程中的功能。首先将幼鱼麻醉后置于琼脂糖模具的凹槽中，随后将注射针插入心脏心室。

然后将形态发生素溶液注入心室4到6次，脉冲之间采用加权时间间隔，以使心脏得以清除。最后，切除鳍并使其再生3天。最终，可通过使用Fiji ImageJ开源软件的线条追踪工具测量鳍的再生面积，来评估其对鳍再生的影响。

与现有的转基因或诱变方法相比，该技术的主要优势在于，它能够利用minos在不适合直接注射的幼虫组织中实现基因敲低。使用直径为0.75毫米的玻璃毛细管，将其插入拉针仪中，并按照以下参数拉制针头；然后在体视显微镜下，配合带有微米刻度目镜的钟表镊子，将拉制好的毛细管折断，制成直径为20微米的针头。接着，使用带有粘合橡胶旋转轮的车床对针头进行打磨，形成20微米的斜面。通过将冻干的Morpho溶解于1×PBS中，配制终浓度为7.5毫摩尔的Morpho储存液。

将2.5微升Morpho储备液与2.8微升1毫摩尔的endo Porter储备液混合，配制成Morpho终浓度为3.5毫摩尔、endo Porter终浓度为0.5毫摩尔的Morpho注射液，用于注射操作。使用带有10微升吸头的微量移液器，吸取5微升Morpho溶液装入斜面玻璃针中。然后将玻璃针插入连接至气动皮升泵的显微操作仪的针座内。

将注射角度调整至约45度，使针头仅需在一个平面方向上移动。接下来，设置显微注射仪的参数如下：维持压力为20磅每平方英寸（PSI），喷射压力为15 PSIA，门控时间范围为100毫秒，周期值设为1.9，对应10.9毫秒。准备20毫升融化的1.5%琼脂糖溶液于XPBS中，并将其倒入一个10厘米的培养皿中。

然后将带有凹槽的注塑模具放入温热的琼脂糖中，以在凝固的凝胶中形成沟槽，用于麻醉幼虫。将幼虫放入含有20毫克/升三卡因的100毫升养殖用水中。待其对触碰不再有反应后，使用塑料移液管小心地将幼虫转移至湿润琼脂糖模具的凹槽中，使幼虫腹侧朝向凹槽的垂直琼脂糖壁。

将斑马鱼幼体置于体视显微镜下，使心室朝向远离注射针的方向。接着，降低注射针，将其插入心脏心室约一至两微米，注意不要插入过深。

然后向心室注入3纳升的Morpholino溶液脉冲，并等待一段时间，使心脏内的液体排空，之后再重复注射5次脉冲。注射完成后，取出针头并将其放入含有1×PBS的培养皿中，以防止针头干燥。接着，使用装有E3培养基的移液器小心地将幼鱼转移回含有新鲜E3培养基的培养皿中，以确保细胞对Morpholino的摄取和维持。在实验期间，每隔12至24小时重复一次注射，以评估注射效果。

将鱼麻醉后，置于覆盖有 E3 培养基的平坦湿润琼脂板上，随后使用具有明场和荧光功能的体视显微镜对其进行成像。使用免费的 Fiji ImageJ 软件分析图像中的再生情况，并利用线条追踪工具测定已发生的再生生长量。首先，在主菜单中将文件拖放到 Fiji 主窗口中以校准图像。

通过点击下拉菜单中的“分析”来设置所有图像的标尺。点击“设置标尺”，然后通过勾选复选框启用全局选项。现在再次拖放图像，以在工具栏中测量再生生长的程度。

选择套索选择工具，圈出待测量的区域，最后按 Ctrl+M。这将打开一个新的结果窗口，显示所圈选区域的面积（单位为平方像素）。如图所示，在注射后数分钟内，Morpho Endo Porter 溶液即分布至血管系统，并进入鳍褶、脑等不同组织，且至少可维持 12 小时或更长时间。

为了评估幼体鳍远端结构的再生情况，需去除以下部分：鳍褶的远端尖端和脊髓、无脊髓的远端区域、此处不可见的远端躯干肌肉，以及色素细胞。色素细胞难以通过直接注射靶向，但似乎可在连续脑室注射后摄取吗啉寡聚物（morpho）。因此，该方法可相对简便地将吗啉寡聚物递送至难以单独靶向的组织，并允许同时评估再生鳍中多个组织内基因的功能。为了分析特定基因在再生过程中的重要性，需对幼体鳍进行部分截除，并切除所有已摄取吗啉寡聚物的组织。

幼鱼的鳍褶在截肢后数天内即可再生其结构，如图所示。此处，吗啉寡聚核苷酸（morpholino）靶向了再生所必需的基因，与未注射组及错配对照吗啉寡聚核苷酸组相比，干扰了再生反应。在该技术的基础上，研究人员得以深入探索斑马鱼鳍再生过程中所涉及的分子机制。