类球体的免疫荧光染色：一种用于分析类球体胞内和胞外抗原表达的技术

— 类球体是一种三维体外细胞培养模型。进行免疫荧光染色时，首先在多孔板中培养所需细胞类型的类球体。使用带有宽孔吸头的微量移液器收集类球体，注意避免因剪切力导致类球体破裂。

接下来，固定并透化球状体，使单个细胞具有通透性。随后，用含有蛋白质的溶液孵育，以阻断细胞表面非特异性蛋白结合位点。用所需的初级抗体混合液处理球状体。孵育使抗体与细胞表面的目标分子结合。

接下来，使用针对一抗的荧光标记二抗溶液对类球体进行标记。最后，用合适的荧光DNA结合染料处理类球体，以染色细胞核。利用激光扫描荧光显微镜，在不同光学层面获取类球体的多个光学横截面图像。

所捕获的图像反映了荧光标记的细胞核和目标抗原。使用相应的软件合并图像序列，以获得三维球状体的最终复合图像。在以下实验方案中，我们将对在刺激物 TGF beta 1 存在条件下培养的胰腺成纤维细胞和癌相关成纤维细胞的球状体进行免疫荧光染色。

— 首先，剪掉移液器吸头末端以扩大开口。孵育完成后，使用这种剪过的移液吸头按实验条件或待分析蛋白分别收集类球体至一个1.5毫升反应管中。在1,000 × g离心约30至60秒以沉淀类球体。用移液器小心吸除含甲基纤维素的上清液，注意不要扰动沉淀的类球体。

— 在将类球体转移至反应管时需格外小心。务必通过剪切管尖来避免产生剪切力。同时，确保收集全部类球体。在洗涤步骤中，注意通过吸液操作时不要丢失类球体。

— 用50微升1× PBS洗涤类球体，以1,000 × g离心30至60秒，然后小心地用移液枪吸除PBS。根据待染色的蛋白，将类球体用50微升含4%多聚甲醛的PBS在室温下固定20分钟。

用 PBS 按前述方法洗涤类球体。在室温下用含 0.1% Triton X 的 PBS 处理类球体 4 分钟以通透细胞。然后按前述方法用 PBS 洗涤类球体三次。向类球体中加入含 5% FBS 和 2% BSA 的 PBS，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性蛋白结合位点。

现在，将类球体与含有2.5% FBS和1% BSA的PBS中的30微升一抗在4摄氏度下孵育过夜。次日，按照之前所述方法用PBS洗涤类球体三次。

此后，将类球体与含有2.5% FBS和1% BSA的PBS中的30微升二抗在室温下孵育90分钟。按照前述方法用PBS洗涤类球体三次。

接下来，在室温下用 30 µL DAPI 染色液孵育细胞 4 分钟。按照前述方法用 PBS 洗涤类球体一次。使用玻璃巴斯德吸管，将类球体置于载玻片上的 PBS 液滴中。采用激光扫描显微镜以 10 倍放大倍数通过荧光显微镜对类球体进行成像。在 Z-stack 的不同光学层面获取类球体的不同光学横截面图像。