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- 球状体是三维体外细胞培养模型。对于免疫荧光染色，首先，在多孔板中生成所需细胞类型的球状体培养物。使用带有宽孔尖端的微量移液器收集球体，注意避免因剪切力而破裂。
接下来，固定和透化球体以使单个细胞具有渗透性。现在，与含有蛋白质的溶液一起孵育，以阻断细胞表面的非特异性蛋白质相互作用位点。用所需的一抗混合物处理球状体。孵育抗体以与细胞表面的靶分子结合。
接下来，用对一抗具有特异性的荧光标记的二抗溶液标记球状体。最后，用合适的荧光 DNA 结合染料处理球状体以对细胞核进行染色。使用激光扫描荧光显微镜，在不同光学平面上对球体的多个光学横截面进行成像。
捕获的图像反映了荧光标记的细胞核和感兴趣的抗原。使用相关软件合并堆栈以获得 3D 球体的最终合成图像。在以下方案中，我们将对在兴奋剂 TGF β 1 存在下培养的胰腺成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞的球体进行免疫荧光染色。
- 首先，切掉移液器吸头的末端以扩大孔口。孵育完成后，根据实验条件或要分析的蛋白质，使用此切割移液器吸头将微球收集到一个 1.5 mL 反应管中。以 1,000 倍 g 离心球体约 30 至 60 秒。通过移液小心地去除含有甲基纤维素的上清液，确保不会干扰沉淀的球体。
- 将球体转移到反应管时要特别小心。确保切割尖端时没有剪切应力。收集所有椭球体也很重要。在洗涤步骤中，确保不会因吸入而丢失球状体。
- 要用 50 μL 1X PBS 洗涤球状体，请以 1,000 倍 g 离心 30 至 60 秒，然后通过移液小心地去除 PBS。根据要染色的蛋白质，在室温下用 50 μL 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定球状体 20 分钟。
如前所述，用 PBS 洗涤球体。在室温下用 0.1% Triton X 的 PBS 溶液透化细胞 4 分钟。然后如前所述，在 PBS 中洗涤球体 3 次。将含有 5% FBS 和 2% BSA 的 PBS 添加到球状体中，并在室温下孵育 1 小时以封闭非特异性蛋白质相互作用位点。
现在，将球体与 30 微升一抗在 PBS 中，含 2.5% FBS 和 1% BSA 在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天，如前所述，在 PBS 中洗涤球体 3 次。
之后，将球状体与 30 μL 二抗在含 2.5% FBS 和 1% BSA 的 PBS 中在室温下孵育 90 分钟。如前所述，在 PBS 中洗涤球体 3 次。
接下来，将细胞与 30 μL DAPI 染色溶液在室温下孵育 4 分钟。如前所述，在 PBS 中洗涤球体一次。使用玻璃巴斯德移液器，将球体放在载玻片上，加入一滴 PBS。使用激光扫描显微镜通过荧光显微镜以 10 倍的放大倍率对球体进行成像。在 Z 堆栈的不同光学平面上取椭球体的不同光学横截面。
