0 次观看 • 3:50 分钟 • April 30th, 2023
— 活性氧主要在线粒体中产生，当电子从电子传递链泄漏时，会与分子氧结合，生成多种活性氧（ROS）。在癌细胞中，活性氧的生成量显著增加。这些高反应性的ROS分子可对细胞内的膜结构、蛋白质和DNA造成氧化损伤。
活性氧（ROS）水平升高可损伤DNA，导致致癌信号通路的激活，从而促进癌症进展。因此，检测癌细胞产生的活性氧水平至关重要。
首先，从人结直肠癌组织中获取癌细胞，并将其置于适当的培养基中培养。接着，将这些细胞接种至多孔板中，并加入DCFH-DA溶液。将多孔板孵育所需的时间。DCFH-DA可穿过细胞膜。进入细胞后，在细胞内酯酶的作用下，DCFH-DA转化为DCFH。随后，DCFH被活性氧物种氧化，生成绿色荧光分子。
在荧光显微镜下观察细胞。绿色荧光的强度表示细胞内活性氧的水平。在以下实验方案中，我们使用 DCFH-DA 染料对结直肠癌细胞中的活性氧进行染色。
— 为了染色细胞，移除含有药物的培养基，并用 DMEM 洗涤一次。每孔加入 500 微升 DCFH-DA 工作液，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。孵育结束后，从孔中移除 DCFH-DA 溶液，用 DMEM 洗涤两次，再用 PBS 洗涤一次。
然后，向每个孔中加入 500 微升 PBS。使用荧光显微镜的绿色荧光蛋白通道拍摄细胞的代表性图像。随后，移除 PBS，并向每个孔中加入 200 微升放射免疫沉淀分析缓冲液。
将培养板置于冰上孵育五分钟，然后将细胞裂解物收集到1.5毫升离心管中。在4摄氏度下，以21,130 × g离心10分钟。随后，将100微升上清液转移至黑色96孔板中。使用酶标仪在激发波长485纳米、发射波长530纳米的条件下测定各孔的荧光强度。
接着，通过将1 µL上清液转移至含100 µL蛋白检测试剂的透明96孔板中，使用Bradford法测定蛋白浓度。利用蛋白浓度对荧光强度进行归一化处理。