0 次观看 • 4:07 分钟 • April 30th, 2023
皮肤主要由上层的表皮层和下层的真皮层构成。表皮细胞呈分层排列，从基底层未分化的细胞到外周高度分化的细胞依次分布。为了培养出在形态学和生物化学特性上模拟正常皮肤的皮肤组织，我们可以建立一种器官型皮肤模型。
首先，取一个带有膜插件的多孔板。将真皮成纤维细胞与胶原蛋白混合后加入插件中。孵育以促进胶原基质凝固，从而包埋成纤维细胞并模拟皮肤的真皮层结构。
接下来，在真皮层上加入角质形成细胞悬液。将培养板放入培养箱孵育，使角质形成细胞黏附至真皮隔室。加入表皮分化培养基，以启动角质形成细胞的增殖及表皮层的形成。
最后，将组织移至新的多孔板中。加入分化培养基，使其仅覆盖组织底部，从而形成气-液界面。在孵育过程中，气-液界面可促进角质形成细胞分化为多层分层的表皮结构。
在以下实验方案中，我们将利用分离的人皮肤细胞生成具有真皮和表皮结构的三维类器官皮肤重建模型。
为了生成皮肤重建模型的真皮部分，将孔径为8微米的膜插件放入24孔细胞培养板中。每个插件中，将100,000个成纤维细胞重悬于凝胶中和溶液中。接着，迅速将成纤维细胞悬液与I型胶原按1:3的比例混合，终体积为500 µL，注意避免产生气泡。
然后，使用移液器将悬浮液加入每个插入物中。在无菌操作台内，将插入物置于室温下，不加培养基，静置30分钟，使真皮凝胶沉降。接着，用DMEM覆盖凝胶，并在37摄氏度下孵育过夜。
过夜孵育后，从真皮凝胶中移除 DMEM，并在 37 摄氏度下用 EGM 平衡 2 小时，以生成皮肤重建物的表皮部分。接着，使用移液器从凝胶中移除 EGM。
然后，将重悬于 100 微升 EGM 中的 100,000 个角质形成细胞小心地接种到每层凝胶表面。将重建组织在 37 摄氏度孵育 1.5 小时，使角质形成细胞黏附至真皮凝胶。使用移液器吸头，小心移除插入物壁上的残余凝胶。
接着，向每个重建组织中加入 800 µL 的 EGM，并在 37°C、5% 二氧化碳条件下培养 7 天。
用小型白色移液器吸头小心地从插入壁上移除残留的凝胶。
第8天，将插入物放入6孔板的各个孔中。随后，向每个孔中加入1.2至1.4毫升转移性黑色素瘤培养基，仅浸没皮肤重建物的底部。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养10至17天。