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- 黑色素瘤含有一小部分癌症干细胞亚群，这些细胞同时具有自我更新和肿瘤起始能力。CD133 或 Prominin-1 是一种五肽跨膜糖蛋白，是转移性黑色素瘤癌症干细胞表达的关键标志物之一。要分离 CD133 阳性细胞，首先将原代黑色素瘤细胞悬浮在适当的缓冲液中。
与含有阻断细胞表面非特异性结合位点的蛋白质的封闭试剂一起孵育。用生物素化的 CD133 一抗处理细胞。这些抗体与 CD133 阳性细胞上表达的 CD133 抗原结合。现在，将抗生物素磁性微珠添加到悬浮液中。孵育使微珠与生物素标记的细胞结合。
最后，将孵育的悬浮液通过放置在磁场中的色谱柱。在磁力影响下，所有用微珠标记的 CD133 阳性细胞都会粘附在色谱柱上，而未标记的细胞会通过。收集这些未标记的 CD133 阴性细胞。从磁场中取出色谱柱。使用合适的缓冲液冲洗内容物，以洗脱并收集 CD133 阳性细胞。
在以下方案中，我们将展示从肿瘤组织获得的原发性黑色素瘤培养物中分离 CD133 阳性和阴性癌症干细胞。用预热的 PBS 洗涤 80% 汇合细胞。加入适量的 Accutase 并孵育直至细胞从培养表面分离。在 Quantum 263 培养基中收获细胞，并转移至 50 mL 试管中。
枚举单元格。然后，将所需数量的细胞以 300 x g 和 4 至 8 摄氏度离心 5 分钟。完全吸出上清液，并在 350 μL MACS 缓冲液中重悬至第八个细胞 10 倍。加入 100 μL FcR 封闭试剂和 50 μL CD133/1-生物素。充分混合并在 4 摄氏度下孵育 10 分钟。
用 10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，然后在 300 x g 和 4 至 8 摄氏度下离心 5 分钟。完全吸出上清液。第二次洗涤后，将细胞沉淀重悬于 400 μL MACS 缓冲液中。加入 100 μL 抗生物素微珠并充分混合。在 4 至 8 摄氏度下孵育 15 分钟。
同时，要准备用于磁分离的 MACS 分离器，请将 QuadroMACS 连接到 MACS 分离器多功能支架上。将所需数量的 LS 色谱柱插入 QuadroMACS 磁场的前面。将预分离过滤器放入每个 LS 色谱柱中，并在每个色谱柱下放置一个合适的收集管。
用 3 ml MACS 缓冲液冲洗过滤器和色谱柱，并丢弃流出物。如前所述在 MACS 缓冲液中洗涤细胞后，将细胞重悬于 500 μL MACS 缓冲液中，并将细胞悬液涂在制备的 LS 柱上。每根柱用 3 ml MACS 缓冲液洗涤 3 次。收集未标记的 CD133 阴性细胞组分的总流出物。
接下来，丢弃预分离过滤器，从分离器中取出色谱柱并将其放在合适的收集管上。涂抹 5 毫升 MACS 缓冲液。将柱塞用力推入色谱柱，立即冲洗掉标记的 CD133 阳性细胞。为了提高负馏分的纯度，将细胞悬液涂在新的平衡 LS 柱上，并收集流出物 CD133 负馏分。
