为什么在黑色素瘤的靶点验证中分离CD133阳性细胞至关重要？

分离CD133阳性细胞可实现对肿瘤发生能力和自我更新能力的功能性检测，这对于验证黑色素瘤中癌症干细胞靶点至关重要。该纯化方法减少了非干细胞带来的干扰，提高了靶点依赖性检测结果的可信度。该方法通过将CD133的表达与肿瘤启动潜能相关联，支持机制层面的风险评估。

磁激活细胞分选如何实现干细胞研究中独立变量的分离？

磁珠激活细胞分选通过使用生物素化抗体和微珠仅标记目标细胞群体，分离出CD133阳性和阴性组分，从而建立明确的实验分组。这种对自变量（CD133状态）的分离使研究人员能够将功能差异特异性归因于干细胞的富集。该技术可确保在检测中观察到的表型与所分离的变量相关，而非由混合细胞群体所致。

通过分离CD133定义的黑色素瘤组分，能够实现哪些定量因变量的测量？

分离的组分可实现定量测量，例如成球效率、体内肿瘤启动频率以及对药物反应的差异。这些因变量提供数值化读数，用于比较CD133阳性与阴性细胞之间与干性相关的表型。该方法支持在不同实验条件下对干细胞频率及功能强度进行统计学分析。

为何复制要求对于分离可靠的CD133阳性与阴性黑色素瘤细胞至关重要？

重复实验可确保在不同实验之间分离获得的CD133定义细胞组分具有一致的纯度和活性，这对于可重复的功能检测至关重要。分离效率的差异可能混淆干细胞与非干细胞群体之间的比较，从而影响靶点验证工作的可靠性。在工业环境中，采用标准化操作流程并进行重复运行，有助于建立可靠的纯度和回收率阈值。

在实施黑色素瘤干细胞工作流程中的CD133分离之前，需要具备哪些统计分析能力？

实施需要通过流式细胞术或类似方法量化纯度和得率的能力，以评估分离效率。对分离组分之间的功能检测（例如，肿瘤形成、增殖）进行统计学比较，需要具备计算显著性和效应量的工具。使用分析重复数据的软件，可确保观察到的干细胞表型差异具有统计学有效性，而非源于分离过程的变异性。

黑色素瘤干细胞分离：利用磁性激活细胞分选技术获取CD133阳性和阴性黑色素瘤细胞的方法

JoVE Encyclopedia of Experiments

癌症研究

0 次观看 • 5:40 分钟 • April 30th, 2023

黑色素瘤含有少量具有自我更新和肿瘤起始能力的肿瘤干细胞亚群。CD133（又称Prominin-1）是一种五次跨膜糖蛋白，是转移性黑色素瘤干细胞表达的关键标志物之一。为分离CD133阳性细胞，首先将原代黑色素瘤细胞悬浮于适当的缓冲液中。

使用含有蛋白质的封闭试剂孵育，以封闭细胞表面的非特异性结合位点。用生物素标记的CD133一抗处理细胞。这些抗体可结合在CD133阳性细胞上表达的CD133抗原。随后，向细胞悬液中加入抗生物素磁性微珠。孵育一段时间，使微珠与生物素标记的细胞结合。

最后，将孵育后的悬液通过置于磁场中的分选柱。在磁场作用下，所有与磁珠结合的CD133阳性细胞会滞留在分选柱中，而未标记的细胞则流过。收集这些未标记的CD133阴性细胞。将分选柱移出磁场，用适当的缓冲液冲洗柱内容物，以洗脱并收集CD133阳性细胞。

在以下实验方案中，我们将展示如何从来源于肿瘤组织的原代黑色素瘤培养物中分离出CD133阳性与阴性的肿瘤干细胞。用预热的PBS洗涤融合度达80%的细胞。加入适量的Accutase，孵育至细胞从培养表面脱落。用Quantum 263培养基收集细胞，并转移至50毫升离心管中。

计数细胞。然后，将所需数量的细胞在 300 × g 条件下，于 4 至 8 摄氏度离心 5 分钟。彻底吸除上清液，并将最多 1 × 10⁸ 个细胞重悬于 350 微升 MACS 缓冲液中。加入 100 微升 FcR 阻断试剂和 50 微升 CD133/1-生物素。充分混匀后，在 4 摄氏度孵育 10 分钟。

用10毫升MACS缓冲液洗涤细胞，随后在4至8摄氏度、300 × g条件下离心5分钟。彻底吸除上清液。再次洗涤后，将细胞沉淀重悬于400微升MACS缓冲液中。加入100微升抗生物素微珠，充分混匀。在4至8摄氏度孵育15分钟。

同时，为准备使用MACS分选器进行磁性分离，将QuadroMACS连接至MACS分选器多联支架上。将所需数量的LS柱（柱翼朝前）插入QuadroMACS的磁场中。在每个LS柱中放入一个预分选滤器，并在每个柱子下方放置合适的收集管。

用 3 毫升 MACS 缓冲液冲洗滤膜和层析柱，并弃去流出液。按照前述方法用 MACS 缓冲液洗涤细胞后，将细胞重悬于 500 微升 MACS 缓冲液中，然后将细胞悬液加入已准备好的 LS 层析柱中。每根层析柱用 3 毫升 MACS 缓冲液洗涤三次。收集未标记的 CD133 阴性细胞组分的全部流出液。

接下来，弃去预分离滤器，将柱子从分离器上取下，并置于合适的收集管上。加入5毫升MACS缓冲液。通过用力将推杆插入柱中，立即冲洗出标记的CD133阳性细胞。为了提高阴性组分的纯度，将细胞悬液上样至一个新的平衡过的LS柱，并收集流出的CD133阴性组分。