大鼠坐骨神经轴浆的分离

本实验的总体目标是从外周神经中分离出纯净的轴突胞质或外质。首先通过解剖分离坐骨神经来实现这一目标。实验的第二步是去除神经中的结缔组织，并分离出神经束。

该实验步骤的第三步是将神经小段在低渗培养基中进行孵育。实验的最后一步是在等渗溶液中孵育，随后进行离心和opsm milian操作。最终可通过Western印迹分析获得结果，显示轴突组分得到了高度富集。

大家好，我叫I，Elle And I may Rosenbaum。我们来自科学研究所生物化学系Mike F Labor教授的实验室。今天我们将介绍一种新的Oxy Opat甲磺酰化技术。

与现有的外周神经手动挤压OIS等方法相比，该技术的主要优势在于能够减少血清和胶质污染，从而更有效地获取轴突内容物。我们已采用这一新技术进行opPLA的甲基化分析，以探究坐骨神经损伤后基于D的逆行信号传导机制。

现在开始操作。将两只已处死的8至10周龄Wistar大鼠中的一只侧置于解剖板上，以便直接暴露坐骨神经远端。在大腿中段剃除毛发，并用70%乙醇彻底擦拭。

使用剪刀从大腿处剪除皮肤。小心地剪开股二头肌与浅臀肌之间的脂肪和结缔组织。用镊子提起暴露的坐骨神经部位，并将其取出。

切除的组织段长度约为1.5厘米。将神经组织转移至含有蛋白酶抑制剂的500微升冰上预冷的2×PBS溶液中，置于微量离心管内。保持离心管置于冰上。

在另一只大鼠的对侧以及第二只大鼠的双侧重复解剖操作。用移液管在培养皿底部划痕，并加入两毫升室温的0.2×PBS（含蛋白酶抑制剂）。

在解剖显微镜下，将单根神经转移至培养皿中。用精细镊子夹住神经外膜并将其拉离神经，去除并丢弃外膜，使神经束保留在培养皿中。小心地将各神经束彼此分离，并与培养皿底部分离。

单个卵泡将变得浑浊并漂浮在溶液表面。立即将分离的卵泡转移至含有500 µL含蛋白酶抑制剂的0.2 X PB的微量离心管中。将样品置于冰上保存。

用练习的方法将管内剩余坐骨神经中的神经束分离并收集。去除神经外膜并分离神经束，每条神经操作时间不应超过10分钟。

从冰上取下含有分离后SLES的离心管，在室温下孵育两小时，以释放髓鞘及非轴突结构。每次洗涤均需清洗SLES。

使用镊子轻轻提起 SLES，并将其转移至含有 1 毫升含蛋白酶抑制剂的 2× PBS 的新离心管中。在摇床上震荡管子 5 分钟。在此清洗步骤之后，以该方式清洗 SLES 三次。

将SLES转移至新的空离心管中以去除过量液体，然后转移至含有300 µL含蛋白酶抑制剂的1×PBS的离心管中，在室温下孵育20至30分钟。由于高盐浓度会干扰后续的蛋白质组学操作，因此洗脱物中的盐分需注意控制。在4°C条件下以10,000 ×g离心10分钟，使组织和细胞碎片沉淀，随后用移液器将上清液转移至干净的离心管中。

获得的上清液应透明澄清。使用分光光度计测定蛋白质浓度。

应获得 200 至 250 微克的蛋白质产量。将 op 质粒制备物分装后于 -80 摄氏度保存，可保存长达六个月。避免反复冻融。

以下是通过手动挤压法分离的OP质粒与按照本方案分离的OPSM样品的Western印迹比较。注意，白蛋白和GFAP的水平降低，分别代表血液蛋白和胶质细胞污染减少。相比之下，轴突微管蛋白βIII在此制备样品中富集，表明轴突蛋白含量较高。

观看完本视频后，您应能够充分掌握坐骨神经的解剖方法以及如何正确分离坐骨神经外膜。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。