Name: 从大鼠坐骨神经轴浆隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学习从大鼠坐骨神经中分离轴浆的方法，通过低渗培养基孵育和离心技术获取高纯度轴突成分。该方法可减少血清和胶质细胞污染，适用于神经生物学和轴突功能研究。

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本方案可实现轴浆的分离，同时最大限度减少胶质细胞和血管组织的污染。该方法每次可从一只8至10周龄的Wistar大鼠中获得约70-100 μg的总轴浆蛋白。
1. 解剖坐骨神经
<ol>
 <li>通过吸入 CO2 并随后进行颈椎脱位的方法处死两只大鼠。在开始解剖前，通过触诊确认无心跳以验证动物死亡。</li>
 <li>用 70% 乙醇擦拭解剖区域。</li>
 <li>剪开皮肤，小心使用剪刀和镊子分离肌肉并分离坐骨神经，避免损伤血管。从每只动物中分离双侧坐骨神经（每根约 1.5 cm），并将四根神经全部收集至一个离心管中，加入 500 μL 0.2X PBS + 抑制剂，并置于冰上保存。</li>
 <li>将神经段转移至含有至少 2 mL 0.2X PBS + 蛋白酶抑制剂的塑料培养皿中。</li>
 <li>在双目显微镜下使用精细镊子去除神经的外膜。极其小心地分离神经束，直至其变得浑浊并开始漂浮于溶液表面。此步骤需反复练习，以确保能够快速而准确地完成（每根神经不超过 10 分钟）。</li>
</ol>
2. 孵育、洗涤与洗脱
<ol>
 <li>将分离的神经束转移至含有500 μL含蛋白酶抑制剂的0.2X PBS的离心管中，在室温下孵育2小时。</li>
 <li>用1 mL相同缓冲液至少洗涤3次，每次将神经束从一个离心管转移至另一个离心管，并在转移后振荡5分钟。</li>
 <li>为去除多余液体，先将神经束放入一个新的空离心管中，然后将其转移至含有300 μL含蛋白酶抑制剂的1X PBS的新的离心管中，在室温下孵育20–30分钟。</li>
 <li>在4°C下以10,000 × g离心10分钟。</li>
 <li>收集上清液并测定蛋白浓度。此即为轴浆制备物。</li>
</ol>
3. 代表性结果
<img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="脑组织提取物的Western印迹分析；检测蛋白：白蛋白、Tubulin β3、GFAP、gERK，分子量范围65-42kDa。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用手动挤压法分离的轴浆与本方案所述方法分离的轴浆样品的Western印迹比较。 可见白蛋白和GFAP水平显著降低，分别代表血液蛋白和胶质细胞污染减少。相反，轴突特异性蛋白Tubulin β3在此样品中富集，表明轴突蛋白纯度较高。

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

生化与蛋白质组学分析已证实，与先前报道的通过机械挤压法分离轴浆的方法1相比，该操作可减少血清和胶质细胞的污染3。我们已采用此轴浆分离方案研究坐骨神经损伤后驱动蛋白介导的逆行信号传导2，并预期其在探索成年外周神经中许多其他过程（包括轴突-胶质细胞相互作用4）方面具有广泛应用价值。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;雄性Wistar大鼠（8-10周龄）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;含蛋白酶抑制剂（Roshe）的PBS 0.2X和PBS 1X溶液（每50 ml加2片）&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1.5 ml离心管&lt;/li&gt; &lt;li&gt;35 mm无菌塑料培养皿&lt;/li&gt; &lt;li&gt;解剖工具，包括：剪刀和精细镊子&lt;/li&gt; &lt;li&gt;双目显微镜及台灯&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">抗体&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">小鼠抗GFAP单克隆抗体G-A-5购自Sigma公司（货号G6171）。兔抗白蛋白抗体购自Cedarlane公司（货号CLAG5140）。小鼠抗微管蛋白&amp;#946;3抗体和兔抗gERK抗体均购自Sigma公司（货号分别为T2200和M5670）。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

大鼠坐骨神经轴浆的分离

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

从周围神经中分离纯化的轴突胞质（轴浆）对于研究多种生物学过程的生化分析至关重要。本文中，我们演示并描述了一种从成年大鼠坐骨神经中分离轴浆的实验方案，该方案基于以下步骤：（1）解剖神经束并分离结缔组织；（2）将神经束的短段在低渗介质中孵育，以释放髓鞘并裂解非轴突结构；（3）提取剩余的富含轴突的物质。对该制备物的蛋白质组学和生化表征已证实其对轴突组分具有高度富集。

我们展示了一种从成年大鼠坐骨神经中分离轴浆的方案，该方法基于神经束的解剖以及在低渗培养基中孵育，以释放髓鞘并裂解非轴突结构，随后提取剩余的富含轴突的物质。

从外周神经中分离纯化的轴突胞质（axoplasm）对于多种生物学过程的生化研究至关重要。本文中，我们……

本实验的总体目标是从外周神经中分离出纯净的轴突胞质或外质。首先通过解剖分离坐骨神经来实现这一目标。实验的第二步是去除神经中的结缔组织，并分离出神经束。该实验步骤的第三步是将神经小段在低渗培养基中进行孵育。实验的最后一步是在等渗溶液中孵育，随后进行离心和opsm milian操作。最终可通过Western印迹分析获得结果，显示轴突组分得到了高度富集。大家好，我叫I，Elle And I may Rosenbaum。我们来自科学研究所生物化学系Mike F Labor教授的实验室。今天我们将介绍一种新的Oxy Opat甲磺酰化技术。与现有的外周神经手动挤压OIS等方法相比，该技术的主要优势在于能够减少血清和胶质污染，从而更有效地获取轴突内容物。我们已采用这一新技术进行opPLA的甲基化分析，以探究坐骨神经损伤后基于D的逆行信号传导机制。现在开始操作。将两只已处死的8至10周龄Wistar大鼠中的一只侧置于解剖板上，以便直接暴露坐骨神经远端。在大腿中段剃除毛发，并用70%乙醇彻底擦拭。使用剪刀从大腿处剪除皮肤。小心地剪开股二头肌与浅臀肌之间的脂肪和结缔组织。用镊子提起暴露的坐骨神经部位，并将其取出。切除的组织段长度约为1.5厘米。将神经组织转移至含有蛋白酶抑制剂的500微升冰上预冷的2×PBS溶液中，置于微量离心管内。保持离心管置于冰上。在另一只大鼠的对侧以及第二只大鼠的双侧重复解剖操作。用移液管在培养皿底部划痕，并加入两毫升室温的0.2×PBS（含蛋白酶抑制剂）。在解剖显微镜下，将单根神经转移至培养皿中。用精细镊子夹住神经外膜并将其拉离神经，去除并丢弃外膜，使神经束保留在培养皿中。小心地将各神经束彼此分离，并与培养皿底部分离。单个卵泡将变得浑浊并漂浮在溶液表面。立即将分离的卵泡转移至含有500 µL含蛋白酶抑制剂的0.2 X PB的微量离心管中。将样品置于冰上保存。用练习的方法将管内剩余坐骨神经中的神经束分离并收集。去除神经外膜并分离神经束，每条神经操作时间不应超过10分钟。从冰上取下含有分离后SLES的离心管，在室温下孵育两小时，以释放髓鞘及非轴突结构。每次洗涤均需清洗SLES。使用镊子轻轻提起 SLES，并将其转移至含有 1 毫升含蛋白酶抑制剂的 2× PBS 的新离心管中。在摇床上震荡管子 5 分钟。在此清洗步骤之后，以该方式清洗 SLES 三次。将SLES转移至新的空离心管中以去除过量液体，然后转移至含有300 µL含蛋白酶抑制剂的1×PBS的离心管中，在室温下孵育20至30分钟。由于高盐浓度会干扰后续的蛋白质组学操作，因此洗脱物中的盐分需注意控制。在4°C条件下以10,000 ×g离心10分钟，使组织和细胞碎片沉淀，随后用移液器将上清液转移至干净的离心管中。获得的上清液应透明澄清。使用分光光度计测定蛋白质浓度。应获得 200 至 250 微克的蛋白质产量。将 op 质粒制备物分装后于 -80 摄氏度保存，可保存长达六个月。避免反复冻融。以下是通过手动挤压法分离的OP质粒与按照本方案分离的OPSM样品的Western印迹比较。注意，白蛋白和GFAP的水平降低，分别代表血液蛋白和胶质细胞污染减少。相比之下，轴突微管蛋白βIII在此制备样品中富集，表明轴突蛋白含量较高。观看完本视频后，您应能够充分掌握坐骨神经的解剖方法以及如何正确分离坐骨神经外膜。以上就是全部内容。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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从大鼠坐骨神经轴浆隔离

由于手术操作简便且行为学结果稳定，坐骨神经慢性压迫是神经病理性疼痛的主要动物模型之一。术后24小时内即可形成疼痛过敏状态，并可使用冯·弗赖麻醉计（机械测试）和足底镇痛仪（热测试）进行定量测量。...

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