从大鼠坐骨神经轴浆隔离
2010年9月24日
我们展示基于神经分册，并在低渗介质孵化剥离释放髓鞘裂解非轴索结构，其余轴突丰富的材料提取成年大鼠坐骨神经神经轴浆隔离协议。
该程序的总体目标是从周围神经中分离纯轴突细胞质或外质。这是通过首先解剖坐骨神经来完成的。该程序的第二步是从神经中去除结缔组织并分离出 sles。
该程序的第三步是在低渗介质中孵育神经 sles 的短段。该程序的最后一步是在等渗溶液离心和 opsm milian 中孵育。最终，可以通过 western blot 分析获得显示轴突成分高度富集的结果。
嗨，我叫 I， Elle 和 May Rosenbaum。我们来自生物化学系科学研究所 Mike F 教授的实验室。今天，我们将介绍一种新的 Oxy Opat 甲氨酰化技术。
该技术的主要优势高于现有方法，例如手动挤压周围神经的 OIS。也就是说，该程序减少了血清和 glos 污染达到轴突内容物。我们使用这种新技术进行 op PLAs 甲基化，以探索坐骨神经损伤后基于 D 的逆转录信号传导。
那么让我们开始吧。将两只安乐死的 8 至 10 周龄 wistar 大鼠中的一只侧放在解剖垫上，以直接接近坐骨神经的远端部分。剃掉大腿中部的皮肤，并用 70% 乙醇彻底交换。
用剪刀剪掉大腿的皮肤。小心切开股二头肌和臀浅肌之间的脂肪和结缔组织。使用镊子提起坐骨神经的暴露区域并将其切除。
被移除的部分将长约 1.5 厘米。将神经转移到微量离心管中 500 微升冰冷的 2X PBS 中，加入蛋白酶抑制剂。将试管放在冰上。
在大鼠的另一侧和第二只大鼠的两侧重复解剖程序。用粘贴移液管刮擦培养皿的底部，并用 2 毫升室温填充。点 2 X PB s，含蛋白酶抑制剂。
在解剖显微镜下将单根神经转移到培养皿中。使用细镊子将其拉开并丢弃，将其从神经中取出，将表面留在培养皿中。小心地将 facis 彼此分开，并将盘子底部分开。
单个 fales 会变得浑浊并漂浮在溶液表面。立即将分离的 fales 转移到含有 500 μL 0.2 X PB s 和蛋白酶抑制剂的微量离心管中。将雪橇放在冰上。
通过练习从管中剩余的坐骨神经中分离并收集 sles。去除神经外膜和分离 sles。每条神经的时间不应超过 10 分钟。
从冰中取出装有分离的 SLES 的试管。在室温下孵育 2 小时，以释放髓鞘和虱子非轴突结构。每次洗涤都要清洗 sles。
使用镊子轻轻提起 sles，并将其转移到含有 1 毫升 2X PB s 和蛋白酶抑制剂的新试管中。在摇杆上摇晃试管 5 分钟。清洗后以这种方式清洗 SLES 三次。
将 SLES 转移到新鲜的空 einor 管中以去除多余的液体，然后转移到含有 300 μL 含变形杆菌抑制剂的 one XPBS 的试管中，在室温下孵育 20 至 30 分钟。为了洗脱 OPSM，较高的盐浓度会干扰进一步的蛋白质组学程序。将分束在 10， 000 个奶酪中在 4 摄氏度下离心 10 分钟，以将上清液上的组织和细胞碎片沉淀到干净的 einor 管中。
得到的上清液。应该很清楚。使用分光光度计测量蛋白质浓度。
应获得 200 至 250 μg 蛋白质的产量。将 op plasm 制备物分装在零下 80 摄氏度下储存长达六个月。避免解冻和冷冻循环。
这是一个蛋白质单元，比较了通过手动挤压方法分离的 op 质与本方案中所示的分离的 opsm 样品。请注意白蛋白和 GFAP 水平降低，分别代表血液蛋白和神经胶质细胞污染。相比之下，轴突微管蛋白 β 3 在该制剂中富集，表明轴突蛋白水平高。
看完所有这些视频后，您应该对如何解剖坐神经以及如何正确分离 Paco 有一个很好的了解。就是这样。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文介绍了一种详细的从成年大鼠坐骨神经中分离轴突质的方案。该方法涉及神经束的解剖和在低渗介质中孵育，以有效释放髓鞘和溶解非轴突结构，从而提取富含轴突的物质。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 轴突研究
背景
- 轴突细胞质的分离对于研究神经元功能至关重要。
- 坐骨神经是外周神经研究的模型。
- 了解轴突成分可以帮助神经研究。
- 之前的方法可能无法产生纯净的轴突物质。
研究目的
- 开发一个可靠的轴突质分离方案。
- 提高轴突细胞质的纯度以便进一步分析。
- 使用生化技术促进轴突成分的研究。
使用的方法
- 解剖坐骨神经以接触神经束。
- 去除神经周围的结缔组织。
- 在低渗介质中孵育神经段。
- 随后在等渗溶液中离心和孵育。
主要结果
- 该方案成功分离出轴突细胞质。
- 蛋白质印迹分析证实了轴突成分的高度富集。
- 结果证明了该方法的有效性。
- 突出了该方案在研究轴突生物学中的潜在应用。
结论
- 该方法为轴突质分离提供了一种稳健的方法。
- 可以在各种与神经元功能相关的研究中使用。
- 研究结果有助于理解轴突的结构和功能。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
