坐骨神经慢性缩窄性损伤及大鼠疼痛过敏检测

本实验的总体目标是对坐骨神经实施慢性压迫损伤，这是一种常用的神经病理性疼痛啮齿类动物模型，并对由此产生的疼痛行为进行定量测量。首先，在大腿中段水平的暴露坐骨神经周围放置四条铬制肠线结扎线，以造成坐骨神经的压迫性损伤。随后，在预定的时间点，通过使用冯·弗雷丝状纤维（von Frey hair）定量测定后肢足底对机械刺激的缩足阈值，以及使用足底镇痛仪测定对热刺激的缩足潜伏期，来监测后肢足部的疼痛行为。

最终结果可显示通过测量对机械和热刺激诱发的缩足反应，能够证实损伤后后肢足部存在机械性和热性疼痛及痛觉过敏。这种由Bene和Z首次建立的外周神经损伤方法，有助于回答慢性疼痛领域中的关键问题，例如神经病理性疼痛产生的外周和中枢机制是什么。该技术的应用意义延伸至神经病理性疼痛的治疗，因为此模型为探索减轻痛觉过敏的新策略提供了基础。

通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将 cmic 肠缝线环绕在静止的神经周围，并达到足以造成适度但不过度神经损伤的合适紧度，具有较大挑战性。开始该操作时，先用 70% 乙醇对术区表面进行消毒，并准备好已预先高压灭菌的无菌器械、纱布、缝合钉和棉片。随后，将大鼠置于诱导麻醉室中，使用 5% 异氟烷进行麻醉。

手术期间通过定制的面罩向其输送2%异氟烷。随后剃除大鼠左侧后肢的毛发，将动物置于37摄氏度的温控加热垫上。在眼睛上涂抹润滑性眼膏。

然后准备铬制肠线缝合线，将其剪成约三厘米长的小段，并浸入无菌生理盐水中。接下来，用酒精和碘溶液交替涂抹三次，对已剃毛的区域进行消毒。将动物俯卧放置，抬起其左后肢，用胶带固定足部，使股骨与脊柱呈90度角。

然后在股骨下方约三到四毫米处的皮肤上做一切口。通过切开结缔组织，将切口周围的皮肤与肌肉分离。使用一把钝头剪刀剪开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。

接下来，使用牵开器扩大两块肌肉之间的间隙，以清晰暴露坐骨神经，然后用镊子和显微剪刀轻轻分离坐骨神经周围结缔组织，暴露出约10毫米长的坐骨神经。在每根结扎线处，于坐骨神经三分叉的近端打第一个结扎结，起始时先打一个松散的单圈结。

然后捏住线的两端靠近环结处，轻轻拉紧，直至环结刚好贴合，且结扎线不会在神经上滑动。接着，保持环结处于正确位置，再在第一个环结之上打第二个环结以完成打结。随后，剪去结扎线的游离端，使其残端长度约为1毫米，确保对神经的缩窄程度最小。

对剩余的三条结扎线重复上述步骤，每条新增的结扎线均比前一条更靠近近端1毫米。手术结束时，同样进行轻微结扎，使用缝线关闭肌肉层，并用钉皮钉固定皮肤。接下来，使用碘溶液对伤口进行消毒。

在麻醉恢复期间密切观察动物，并将其置于单独的笼子中恢复，笼内铺有平铺的纸垫。在开始实验前，应每天对动物进行数天的抓取操作训练。

然后在行为学测试之前，将大鼠放入饲养环境中进行适应。测试环境应保持安静，并严格控制温度和湿度，每次测试应在每天大致相同的时间进行。在测试当天为研究机械缩足阈值，将大鼠放入架高的网状地板测试笼中，在实验开始前15至30分钟使用动态足底von Frey纤维丝触觉刺激仪，将刺激装置的纤维丝正对后肢足底中点下方，并按下启动键。

通过逐渐增加的力，将细丝抬起以机械刺激后肢足底表面。随后，记录损伤侧和未损伤侧后肢的机械缩足阈值。该设备可自动记录并显示缩足反应时施加的最大值。

以交叉平衡的顺序对未损伤的后肢足底进行三次机械刺激，每次刺激之间间隔约五分钟，然后计算足底回缩阈值的平均值。在测试当天，为研究热刺激回缩潜伏期，将大鼠放入玻璃地板的测试笼中，实验前15至30分钟使用热辐射镇痛仪，将红外热源对准后肢足底中部区域，然后按下启动键。

通过透明玻璃表面，将辐射热光束照射至后肢足底表面，暴露其足底区域。随后记录损伤侧与未损伤侧后肢足爪的回缩潜伏期。该设备可自动记录从热刺激开始至足爪离开热源所需的时间。

以交叉平衡的顺序对损伤和未损伤的后肢足爪进行热刺激测试，每次刺激之间间隔约五分钟，至少重复三次，然后计算足爪回缩潜伏期的平均值。此处显示的是Wistar大鼠在坐骨神经慢性压迫前及压迫后长达12天内，损伤侧与未损伤侧后肢足爪的机械回缩阈值。与未损伤的对侧后肢足爪相比，损伤的同侧后肢足爪对机械刺激的回缩阈值显著降低。此处展示的是坐骨神经慢性压迫前及压迫后长达12天内，损伤侧与未损伤侧后肢足爪的热刺激回缩潜伏期。

同样，与未受伤的对侧后肢足掌相比，受损的同侧后肢足掌的热缩足潜伏期显著缩短。一旦掌握，每只动物的 CCI 手术可在短短 20 分钟内规范完成，从而导致后肢足掌长期的疼痛过敏。在实施该操作时，需注意结扎线应松紧适度，因为结扎线下方组织在发生水肿后会自行绞窄，进而引起神经压迫，这是术后产生疼痛敏感的关键机制。

这种外周神经损伤技术结合疼痛超敏反应P波检测，可为神经病理性疼痛领域的研究人员探索神经损伤所致慢性疼痛的潜在机制提供帮助。