Name: 慢性缩窄大鼠坐骨神经疼痛过敏测试 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习慢性缩窄大鼠坐骨神经损伤模型，通过机械和热刺激定量测量疼痛行为。该方法使用von Frey纤维丝和热痛仪评估痛觉过敏，为研究神经病理性疼痛的外周和中枢机制提供可靠基础。

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作者谨此致谢 Bennett 和 Xie（1988 年）对 CCI 模型的最初描述。
本工作部分得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（项目编号 #568637）和新南威尔士州科学与医学研究办公室对GMT的资助。

1. 坐骨神经慢性缩窄
手术过程中应采用无菌技术。使用70%乙醇对手术工作台面进行消毒，并提前通过高压灭菌准备无菌器械（如精细剪刀、镊子和牵开器）、纱布、缝合钉和棉拭子。对于多台手术，在大鼠之间需使用70%乙醇或干珠灭菌器对器械进行清洁和重新灭菌。操作者应佩戴外科口罩、头帽和无菌手套。
为进行神经结扎，将铬制肠线剪成约3 cm长的小段，并浸泡于无菌生理盐水中以防止干燥。用于关闭切口时，使用市售的无菌丝线缝合线。
<ol>
	<li>在诱导室中使用5%异氟烷与O₂混合气体对大鼠进行麻醉2，然后输送含2%异氟烷的O₂2 通过定制的面罩给药，并在操作过程中监测麻醉动物的状态。常用的替代麻醉剂包括吸入式氟烷或腹腔注射的戊巴比妥钠。应避免使用氯胺酮，因为其作为N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂，可能干扰神经病理性疼痛相关机制的研究。</li>
	<li>剃除大鼠左后肢的毛发，然后将动物置于恒温加热垫上 37°C 并在眼睛上涂抹润滑性眼用软膏。</li>
	<li>用70%异丙醇和碘溶液交替擦拭剃毛区域三次以进行消毒。</li>
	<li>大鼠俯卧时，抬起其左后肢，固定于股骨位置 90° 用美纹纸胶带将足部固定于脊柱。</li>
	<li>在股骨下方3-4 mm处平行于股骨做皮肤切口，并通过切开结缔组织将切口周围皮肤与肌肉分离。</li>
	<li>使用钝头剪刀剪开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。</li>
	<li>使用拉钩扩大两块肌肉之间的间隙，以清晰显露坐骨神经。</li>
	<li>使用弯头钝头镊子和显微剪刀，小心地从周围结缔组织中游离出约10 mm长的坐骨神经（位于坐骨神经三分叉近端）。</li>
	<li>在显微镜和良好光源下，于坐骨神经三分叉处近端1 mm处，用铬制肠线（4.0，Ethicon，USA）打四个双结结扎线，各结扎线间距1 mm。每个结扎操作时，先打一个单圈松结，然后捏住线的两端靠近结环处，缓慢收紧，直至结环刚好贴合神经而不滑动为止。为固定结环位置，再在第一个结上加一个结环以完成双结。最后将结扎线的游离端剪至约1 mm长。神经的压迫应尽可能轻微，一旦观察到短暂的肌肉抽搐应立即停止结扎，以避免阻断神经外膜血流。结扎过紧会导致轴突切断和自残行为（自残），这两种均为不良副作用，会影响疼痛超敏反应测试的成功进行。</li>
	<li>使用缝线（Mersilk 5.0，Ethicon）缝合肌肉层，用钉合器（Autoclip，9 mm）闭合皮肤。随后，使用碘溶液（Riodine）对伤口进行消毒。</li>
	<li>在麻醉复苏期间密切观察大鼠，并将其置于单独的笼子中恢复，笼内铺平纸垫料（非标准动物饲养垫料），以防止无意识动物发生窒息。 
	在给予任何术后镇痛之前，研究人员应考虑到镇痛可能干扰痛觉过敏测试。事实上，已有证据表明，在损伤时局部应用麻醉剂利多卡因可能改变神经病理性疼痛的发展，并减弱此前数周内的痛觉过敏程度。7有关此问题的进一步讨论，请参见 Bennett 的综述 等8.</li>
</ol>
2. 疼痛行为的测量
<ol>
	<li>建议在开始实验前数天每天对大鼠进行抓取操作，以使大鼠适应操作者，减少应激反应及咬伤风险。</li>
	<li>在行为学测试前，大鼠需适应测试程序及动物饲养环境。测试环境应保持安静且严格控制，温度和湿度恒定，并在每次测试时尽量安排在每天的相同时间段进行。</li>
	<li>疼痛过敏测试应在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）前多次进行（作为基线），并根据需要在CCI后不同时间点重复进行。</li>
</ol>
3. 机械缩足阈值
<ol>
	<li>测试当天，在测量缩足阈值前15-30分钟，将大鼠放入带有高架金属网底的测试笼中，使其进行笼内探索和理毛活动直至停止，大鼠逐渐放松并保持静止。</li>
	<li>使用动态足底 von Frey 机械痛觉测量仪（Ugo Basile，意大利），将触觉刺激装置的探丝置于后肢足底中点下方，避免接触金属网，然后按下启动键。仪器将自动抬升探丝，以递增的力度对后肢足底表面施加机械刺激。</li>
</ol>
手动 von Frey 纤维是一系列直径递增的纤维丝，经过校准后可在施加于皮肤时产生特定的作用力。如先前所述4，它们可作为电子动态足底 von Frey 感觉计的替代方法，用于测量足爪回缩阈值。此外，还有多家厂商生产电子 von Frey 感觉计（例如 IITC，美国和 Somedic，瑞典）。
<ol start="3">
	<li>以交替顺序记录损伤侧和未损伤侧后足的机械缩足阈值。该设备向足部施加压力，当出现缩足反应时，系统会自动记录并显示所施加的最大压力（单位：克）。如果反应不明确（例如出现行走或理毛行为），需重复刺激并再次记录阈值。刺激后后足出现舔舐或抖动行为，表明与疼痛相关的行为反应。</li>
	<li>每次机械刺激间隔约 5 分钟，重复刺激 3 次，记录各次缩足阈值，然后计算后足缩足阈值的平均值。</li>
</ol>
4. 热缩足潜伏期
在开始实验前，应调整足底测试仪器的红外线（I.R.）热强度。在我们的实验室中，我们将 I.R. 强度调整至使正常大鼠的平均足爪回缩潜伏期约为 10 秒，并将截断潜伏期设定为 20 秒，以避免在足爪未回缩时造成组织损伤。
<ol>
	<li>测试当天，在测量潜伏期前15-30分钟将大鼠放入玻璃底测试笼中，使其充分适应环境，待其探索和理毛行为停止后，大鼠处于放松且静止的状态。</li>
	<li>使用热板足底镇痛仪（Ugo Basile，意大利），将红外热源对准后肢足底中部区域，按下启动键。此时，通过透明玻璃表面，足底区域将受到一束辐射热刺激。其他厂商也生产类似的热板足底镇痛仪（例如 IITC，美国；Stoelting，美国）。</li>
	<li>以交叉平衡的顺序分别记录损伤侧与未损伤侧后肢的回缩潜伏期。该设备可自动记录从热刺激开始至足部离开热源所经历的时间（单位为秒）。若出现模糊反应（例如行走或理毛行为），应重复施加刺激并重新记录潜伏期。刺激后出现后肢舔舐或抖动行为，提示与疼痛相关的行为反应。</li>
	<li>每次刺激间隔约5分钟，至少重复热刺激3次，记录各次潜伏期，然后计算后肢回缩潜伏期的平均值。</li>
</ol>
4. 典型结果
大鼠同侧（损伤侧）和对侧（未损伤侧）足爪在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）前（基线）及术后第2至12天的机械缩足阈值与热缩足潜伏期示例 图3A，以及 图3B从这些图中可以看出，CCI 导致同侧后足机械缩足阈值和热缩足潜伏期显著降低，表明存在机械性和热性疼痛过敏现象，二者均为慢性神经病理性疼痛的特征。
<img alt="慢性缩窄性损伤示意图；坐骨神经结扎；脊髓横切面；背根神经节通路。" src="/files/ftp_upload/3393/3393fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1. CCI 模型中结扎线位置的示意图。该神经病理性疼痛动物模型是在大腿中段水平的坐骨神经上放置四条松散的铬肠线结扎线，仅损伤部分通往足部的传入神经纤维，从而导致后肢足垫出现疼痛过敏现象。
<img alt="解剖图，蝙蝠翅膀结构；外侧和内侧部分标有高亮区域。" src="/files/ftp_upload/3393/3393fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于疼痛测试的后足区域示意图。如红色虚线圆圈所示，疼痛测试使用足垫后方的足底中段区域。该区域主要由坐骨神经的终末分支支配。应避免在足跟和足垫处进行测试，因其皮肤敏感性存在差异。
<img alt="术后疼痛反应；显示回缩阈值和潜伏期的折线图；CCI 方法。" src="/files/ftp_upload/3393/3393fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3. 大鼠坐骨神经慢性压迫损伤后出现的疼痛过敏现象。在CCI术后，与未受伤侧（对侧）后肢相比，受伤侧（同侧）后肢对机械刺激的抬足回缩阈值显著降低（A），对热刺激的抬足回缩潜伏期也显著缩短（B）（P&lt;0.01，重复测量双因素方差分析）。数据表示为均值 ± 标准误，n=7 只Wistar大鼠。

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</ol>

动物实验已获得澳大利亚新南威尔士大学动物护理与伦理委员会的批准，并遵循国际疼痛研究协会发布的指南。

坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）是一种广泛使用的慢性神经病理性疼痛的外周神经损伤模型。该模型操作相对简单，且在损伤后至少一个月内可产生显著而稳定的疼痛过敏反应。CCI术后，大鼠会出现患侧后足异常姿势（脚趾并拢、跖屈及足外翻），并频繁出现患侧后足抖动、保护性姿态及舔舐行为，提示存在自发性疼痛9。除了感觉功能障碍外，一些研究者发现CCI还会引发行为功能障碍，例如社交互动受损、睡眠障碍、类似抑郁和焦虑的行为表现10-13，然而也有研究未能观察到类似的行为异常14,15。因此，CCI模型常被用于研究神经病理性疼痛的发病机制以及潜在治疗药物的评估。
我们描述了左侧坐骨神经的单侧结扎，但需要注意的是，许多研究者已在右侧坐骨神经上实施坐骨神经慢性压迫损伤（CCI），并获得了相似的疼痛和行为学结果。由于惯用手的影响，部分研究者可能发现对某一侧进行手术操作更为方便，而另一些研究者则在实验中交替使用左右侧，以排除可能存在的偏倚。值得注意的是，已有多种对原始操作方法的改良被报道，包括仅使用两条结扎线环绕神经16,17，...

<table><tbody><tr><td>铬制肠线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>G-211</td><td>4-0 规格</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Delvet Pty. Ltd., Seven Hills, NSW</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>美外丝线</td><td>Ethicon Inc.</td><td>W-580</td><td>5-0 规格</td></tr><tr><td>自动夹</td><td>BD Biosciences</td><td>427631</td><td>9 mm 不锈钢</td></tr><tr><td>瑞碘</td><td>Orion</td><td>R1000802F</td><td>1% w/v 碘溶液</td></tr><tr><td>热板镇痛测试仪</td><td>Ugo Basile</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>动态足底感觉计</td><td>Ugo Basile</td><td>37400</td><td></td></tr></tbody></table>

坐骨神经慢性缩窄性损伤及大鼠疼痛过敏检测

Chronic Constriction of the Sciatic Nerve and Pain Hypersensitivity Testing in Rats

慢性神经病理性疼痛由中枢或周围神经系统损伤引起，是一种常见且致残的疾病，影响着7%-18%的人群1,2。其症状包括自发性疼痛（如针刺感、灼烧感、电击样疼痛）、感觉异常、感觉迟钝、异常性疼痛（由通常不会引起疼痛的刺激引发的疼痛）以及痛觉过敏（对疼痛刺激的反应增强）。这些感觉症状常伴随行为功能障碍，例如失眠和抑郁。为研究慢性神经病理性疼痛，已开发出多种模拟周围神经损伤的动物模型，其中应用最广泛的是Bennett和Xie（1988年）提出的单侧坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）模型3（图1）。本文介绍了一种实施CCI手术及检测疼痛过敏反应的方法。
在麻醉状态下进行坐骨神经慢性缩窄性损伤（CCI）模型手术，通过皮肤切口暴露一侧的坐骨神经，并切开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。在坐骨神经上以1 mm的间隔松松结扎四道铬制肠线，结扎程度以刚好压迫但不完全阻断神经外膜血流为宜。随后用缝线缝合肌肉层，皮肤则用缝钉闭合。术后让动物恢复24小时，然后开始进行疼痛过敏反应的检测。
进行行为学测试时，将大鼠放入测试装置中，使其适应测试程序。测试区域为后肢足底中部表面（图2），该区域位于坐骨神经支配范围内。通过使用电子动态足底 von Frey 痛觉测定仪或手动 von Frey 纤维丝对损伤和未损伤的后肢进行机械刺激，评估机械缩足阈值4。机械缩足阈值是指引发缩足反应的最大施加压力（单位为克）。对于热缩足潜伏期的测量，采用 Hargreaves et al（1988）首次描述的方法，使用足底镇痛仪通过透明玻璃表面将辐射热光束照射至后肢足底5,6。热刺激引发的缩足潜伏期定义为损伤侧与未损伤侧后肢发生缩足反应所需的时间。在坐骨神经慢性压迫损伤（CCI）后，与基线值及未损伤侧后肢相比，损伤侧后肢的机械缩足阈值和热缩足潜伏期均显著降低（图3）。外周神经损伤的 CCI 模型结合疼痛超敏反应测试，为研究潜在治疗药物对慢性神经病理性疼痛的干预效果提供了一个模型系统。在本实验室中，我们结合 CCI 模型与后肢对热和机械刺激的敏感性，研究神经-免疫相互作用在神经病理性疼痛发生机制及治疗中的作用。

由于手术操作简便且行为学结果稳定，坐骨神经慢性压迫是神经病理性疼痛的主要动物模型之一。术后24小时内即可形成疼痛过敏状态，并可使用冯·弗赖麻醉计（机械测试）和足底镇痛仪（热测试）进行定量测量。

由中枢或外周神经系统损伤引起的慢性神经病理性疼痛是一种常见且致残的疾病，影响着7-18%的人群...

本实验的总体目标是对坐骨神经实施慢性压迫损伤，这是一种常用的神经病理性疼痛啮齿类动物模型，并对由此产生的疼痛行为进行定量测量。首先，在大腿中段水平的暴露坐骨神经周围放置四条铬制肠线结扎线，以造成坐骨神经的压迫性损伤。随后，在预定的时间点，通过使用冯·弗雷丝状纤维（von Frey hair）定量测定后肢足底对机械刺激的缩足阈值，以及使用足底镇痛仪测定对热刺激的缩足潜伏期，来监测后肢足部的疼痛行为。最终结果可显示通过测量对机械和热刺激诱发的缩足反应，能够证实损伤后后肢足部存在机械性和热性疼痛及痛觉过敏。这种由Bene和Z首次建立的外周神经损伤方法，有助于回答慢性疼痛领域中的关键问题，例如神经病理性疼痛产生的外周和中枢机制是什么。该技术的应用意义延伸至神经病理性疼痛的治疗，因为此模型为探索减轻痛觉过敏的新策略提供了基础。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为将 cmic 肠缝线环绕在静止的神经周围，并达到足以造成适度但不过度神经损伤的合适紧度，具有较大挑战性。开始该操作时，先用 70% 乙醇对术区表面进行消毒，并准备好已预先高压灭菌的无菌器械、纱布、缝合钉和棉片。随后，将大鼠置于诱导麻醉室中，使用 5% 异氟烷进行麻醉。手术期间通过定制的面罩向其输送2%异氟烷。随后剃除大鼠左侧后肢的毛发，将动物置于37摄氏度的温控加热垫上。在眼睛上涂抹润滑性眼膏。然后准备铬制肠线缝合线，将其剪成约三厘米长的小段，并浸入无菌生理盐水中。接下来，用酒精和碘溶液交替涂抹三次，对已剃毛的区域进行消毒。将动物俯卧放置，抬起其左后肢，用胶带固定足部，使股骨与脊柱呈90度角。然后在股骨下方约三到四毫米处的皮肤上做一切口。通过切开结缔组织，将切口周围的皮肤与肌肉分离。使用一把钝头剪刀剪开臀浅肌与股二头肌之间的结缔组织。接下来，使用牵开器扩大两块肌肉之间的间隙，以清晰暴露坐骨神经，然后用镊子和显微剪刀轻轻分离坐骨神经周围结缔组织，暴露出约10毫米长的坐骨神经。在每根结扎线处，于坐骨神经三分叉的近端打第一个结扎结，起始时先打一个松散的单圈结。然后捏住线的两端靠近环结处，轻轻拉紧，直至环结刚好贴合，且结扎线不会在神经上滑动。接着，保持环结处于正确位置，再在第一个环结之上打第二个环结以完成打结。随后，剪去结扎线的游离端，使其残端长度约为1毫米，确保对神经的缩窄程度最小。对剩余的三条结扎线重复上述步骤，每条新增的结扎线均比前一条更靠近近端1毫米。手术结束时，同样进行轻微结扎，使用缝线关闭肌肉层，并用钉皮钉固定皮肤。接下来，使用碘溶液对伤口进行消毒。在麻醉恢复期间密切观察动物，并将其置于单独的笼子中恢复，笼内铺有平铺的纸垫。在开始实验前，应每天对动物进行数天的抓取操作训练。然后在行为学测试之前，将大鼠放入饲养环境中进行适应。测试环境应保持安静，并严格控制温度和湿度，每次测试应在每天大致相同的时间进

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

慢性缩窄大鼠坐骨神经疼痛过敏测试

本文描述的 spared nerve injury（SNI）动物模型是一种小鼠模型，通过损伤坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留剩余的腓肠神经完整，从而建立外周神经病理性疼痛模型。由机械性异常性疼痛引起的行为学改变通过 von Frey...

小鼠中诱导机械性异常性疼痛的 spared nerve injury（SNI）模型

我们介绍了两种用于大鼠脊髓损伤急性期或慢性期的触觉感觉测试方法。这些经过验证的实验步骤能够检测类似异常性疼痛感觉的发生和维持。...

大鼠脊髓损伤后急性期与慢性期触觉感觉功能检测

神经病理性疼痛是由影响躯体感觉系统的损伤或疾病引起的后果。小鼠神经病理性疼痛的“套管模型”是将聚乙烯套管植入坐骨神经主支周围。使用冯·弗雷丝（von...

小鼠神经病理性疼痛的坐骨神经套管模型

本文提供了一种建立慢性缺血后疼痛（CPIP）动物模型的实验方案。该模型是模拟人类Ⅰ型复杂性区域疼痛综合征的公认模型。进一步评估CPIP大鼠模型中的机械性和热性痛觉过敏，以及辣椒素诱导的伤害性行为。...

大鼠I型复杂性区域疼痛综合征的慢性缺血后疼痛模型

为了开发用于预防和治疗背痛的新型治疗干预措施，需要借助动物模型从转化医学的角度来研究这些疗法的作用机制和有效性。本方案描述了BMS测试，即一种用于评估大鼠背部机械敏感性的标准化方法。...

大鼠背部机械敏感性评估用于慢性背痛机制研究

坐骨神经部分结扎可诱导产生持续时间较长的慢性神经病理性疼痛，其特征是对热和机械刺激的反应显著增强。该神经病理性疼痛小鼠模型常用于研究疼痛管理方面的创新疗法。本文详细描述了手术操作步骤，以提高实验的标准化程度和可重复性。...

部分坐骨神经结扎：一种用于研究新型疗法镇痛效果的慢性神经病理性疼痛小鼠模型

我们介绍了一种在坐骨神经慢性压迫损伤模型中应用付氏皮下针刺法诱导大鼠坐骨神经痛的实验方案。...

富氏皮下针刺法对坐骨神经痛疗效的研究：慢性缩窄性损伤大鼠模型中的行为学与电生理学变化

小鼠眶下神经远端慢性缩窄性损伤可诱导自发行为改变（面部理毛活动增加）以及对触觉刺激的伤害性行为反应（对von...

小鼠眶下神经远端慢性缩窄损伤（DIoN-CCI）模型用于三叉神经病理性疼痛研究

在此，我们介绍一种用于评估急性麻醉条件下外周神经中感觉轴突激活与阻滞的方法， 体内...

评估麻醉大鼠外周疼痛阻滞的电生理学方法

我们描述了一种通过使用小型金属夹缩窄升主动脉，在Wistar大鼠中建立压力超负荷及左心室肥厚的逐步操作方法。该模型被广泛用于研究心脏肥厚过程中的心肌重塑变化，以及识别和评估逆转此类变化的策略。...

大鼠升主动脉缩窄术用于建立压力超负荷性心肌肥厚模型

学习慢性缩窄大鼠坐骨神经损伤模型，通过机械和热刺激定量测量疼痛行为。该方法使用von Frey纤维丝和热痛仪评估痛觉过敏，为研究神经病理性疼痛的外周和中枢机制提供可靠基础。

坐骨神经慢性缩窄性损伤及大鼠疼痛过敏检测

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