PiggyBac 转座子介导的人 iPSC 基因编辑:使用 PiggyBac 转座子系统将目标基因整合到人 iPSC 中的程序

首先将人诱导的多能干细胞 hiPSC 悬浮在合适的电穿孔缓冲液中。添加由 PiggyBac 转座酶编码质粒和供体质粒组成的溶液。对混合物进行电穿孔。

电脉冲瞬时透化细胞膜，促进细胞对质粒的摄取。供体质粒包含转座子特异性反向末端重复序列 ITR，它们是彼此的反向互补，两侧是包含靶蛋白和抗生素抗性基因的 TTAA 重复序列。

表达的 PiggyBac 转座酶蛋白在 ITR 的 3' 端产生缺口，位于 TTAA 重复序列的内部。暴露的 3'-羟基攻击侧翼 DNA 内的互补链核苷酸，在转座子末端形成 TTAA 发夹，从而从质粒中释放转座子构建体。

转座酶解析发夹，在转座子构建体的 5' 末端形成 TTAA 突出端。转座酶进一步在宿主基因组的 TTAA 序列上产生双链断裂。释放的 3'-羟基转座子末端攻击交错末端的 TTAA 序列，导致转座子构建体与宿主基因组共价连接，在转座子构建体的两侧留下单链间隙。宿主 DNA 中的这些间隙被连接，导致转座子构建体的稳定整合。

用含抗生素的培养基处理接种在细胞外基质蛋白包被板上的 hiPSC。由上游启动子驱动的抗生素抗性基因能够选择基因编辑的细胞。