Name: 检查本地网络处理采用多接触层电极记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: 学习使用多接触层电极记录技术，研究初级视觉皮层不同层中单个神经元和局部场电位如何编码感觉信息。该方法有助于深入理解皮层回路处理视觉刺激的神经机制。

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感谢 Ye Wang 的讨论以及 Sorin Pojoga 的行为训练支持。本研究由 NIH EUREKA 项目、国家眼科研究所、Pew 学者计划、James S. McDonnell 基金会（V.D.）以及 NIH 视觉培训基金（B.J.H.）资助。

1. NAN 微驱动装置的构建
我们将U-Probe与NAN电极驱动系统结合使用。构建该系统需要2-3小时，但一旦建成，后续修改非常简便。我们首先组装NAN塔，包括4通道底座（图2a）、NAN腔室（图2b）、间距为1 mm的网格（图2c）、1-4个螺钉式微型驱动器（图2d）、1-4个导管（图2e，直径500 μm，长度约5-7 cm）、以及1-4个微型驱动器塔（图2f）。为简化说明，我们将描述仅使用一个塔和一个U-Probe构建NAN系统的操作流程。在经过一定训练后，若所有材料齐备，该过程通常耗时2-3小时。
<ol>
 <li>组装NAN电极驱动装置时，首先测量并准备好所需的所有工具和部件（例如导管、导丝、完整的Dremel工具套装、NAN工具与零件以及U型探针）。测量导管长度，确保其连接到记录装置后，能够刚好置于硬脑膜上方而不造成损伤。</li>
 <li>组装NAN电极驱动装置时，首先测量记录腔的深度，然后将导管切割至约5–7 cm的长度。切割导管时需确保无金属碎屑进入管内。使用直径小于导管内径的硬质金属丝清除管内可能残留的金属碎片。</li>
 <li>接下来，将NAN网格插入NAN底座中，拧紧夹紧螺钉和网格固定螺钉。在底座与网格固定后，确定目标记录区域，并从NAN网格底部将导管推进。</li>
 <li>推动导管穿过网格，使其底部伸出NAN腔约1–2 mm。当导管到达理想位置后，开始组装NAN微驱动塔。</li>
 <li>每个NAN微驱动塔包含两个夹具——顶部夹具由电机驱动，底部夹具可固定或松动。将顶部夹具连接至U型探针的加强管上，将底部夹具连接至导管，并涂抹少量超级胶水以固定导管位置。该系统因两个夹具均连接至U型探针的加强管，因而具有更高的稳定性和精确性。</li>
 <li>小心对齐U型探针的尖端与导管顶端，将U型探针穿过导管，直至可将驱动塔固定于NAN底座上。通过调节拇指旋钮调整塔的位置，确保U型探针和导管均无额外张力。</li>
</ol>
2. U-Probe 的灭菌
层流电极或Plextrode U-Probe可从Plexon公司购买，价格约为2000至4000美元。价格取决于三个主要因素：接触位点数量、位点排列方式以及每个位点的直径。我们目前使用的是16通道版本，采用线性排列，接触位点直径为25 μm。重要的是，U-Probe的厚度与接触位点直径直接相关。在我们的实验中，始终使用直径为25 μm的接触点，对应厚度为360 μm。我们所用型号当前的价格约为3500美元。U-Probe以电极盒包装，配有跳线和接地线，从订购到交付的交货周期约为4至6周。
<ol>
 <li>将NAN系统放置在圆柱形底座上，并将电机电缆连接到相应的塔柱。若使用多个塔柱，可使用颜色编码的扎带以帮助区分不同电机电缆与塔柱。</li>
 <li>通过NAN软件程序开始推进U-Probe，可设置一个目标位置，使U-Probe自动推进至该位置，或点击NAN软件界面上的“向下”按钮。推进U-Probe，确保其尖端至少有10 mm穿过导向管并超出NAN腔室末端。</li>
 <li>为对U-Probe进行灭菌，在将其连接至已植入的记录腔室前，将其置于MetriCide活化醛溶液中浸泡20-30分钟。之后，用无菌水冲洗U-Probe和NAN底座。</li>
 <li>通过回撤U-Probe使其尖端刚好位于导向管内部，以对NAN软件中的位置进行归零。在NAN软件中，点击“全部位置归零”。</li>
 <li>将NAN底座连接至已植入的记录腔室，并拧紧全部四个螺钉。然后根据记录腔室侧面的一个定位销对齐底座。再次拧紧全部四个螺钉，并确保NAN底座牢固地固定在记录腔室上。</li>
</ol>
3. 推进 U-Probe 以进行记录
由于不同受试者硬脑膜的强度和厚度存在高度差异，我们采用了一种通用的操作流程，使用NAN微驱动系统推进U-Probe。重要的是，每个U-Probe均附有各电极接触点阻抗的详细分析以及U-Probe的整体参数范围。我们使用的电极接触点阻抗范围为0.3–0.5 MΩ。目前Plexon公司提供可购买的阻抗测试仪，但在我们进行记录时，该设备尚不可用。因此，我们未能对阻抗进行详细分析。
<ol>
 <li>U型探针保持悬空状态（底部连接器上有一个带导线的跳线）。将前置放大器固定到U型探针连接器上，并连接放大器电缆并接地。</li>
 <li>初始推进约1-2 mm时应快速而有力。将推进速度参数设置在0.1 - 0.2 mm/sec范围内，步进深度设为0.2 - 0.3 mm。这些参数值可确保U型探针干净地穿透硬脑膜，是记录过程中的关键第一步。</li>
 <li>一旦穿过硬脑膜，将推进速度降低至0.050 - 0.1 mm/sec，步进深度减小至0.05 - 0.1 mm。目标是以尽可能平稳且缓慢的方式推进U型探针，避免损伤任何组织。探针进入脑组织的标志之一是局部场电位（Text Overlay: local field potential）振幅发生变化，同时噪声水平降低。</li>
 <li>为确认电极已贯穿所有皮层层次，可通过全视野白光闪烁刺激来测量振幅变化。局部场电位振幅随时间的变化构成了诱发电位分析的基础，该分析为识别皮层层次提供了依据。</li>
</ol>
4. 皮层各层的鉴定与验证
我们已建立一种利用诱发电位（ERP）范式和电流源密度（CSD）分析来识别皮层各层的方法。我们采用CSD，因为它能够提供跨膜电流流动的位置、方向和密度的指标，从而帮助我们精确放置电极，实现单次穿刺即可记录所有皮层层的活动。事实上，Charles Schroeder 及其同事此前已结合层状记录、微损毁和组织学重建方法，验证了ERP/CSD方法在V1区皮层功能分层识别中的有效性9-12。此外，也有研究利用自发产生的振荡活动（如皮层纺锤波和上/下状态）来判断皮层深度13-15。
本分析使用 MATLAB 的 iCSD 工具箱，该工具箱通过计算均匀间距的 U-Probe 电极触点上局部场电位（LFP）时间序列的二阶空间导数来得到电流源密度（CSD）（<a href="http://software.incf.org/software/csdplotter/home">http://software.incf.org/software/csdplotter/home</a>）9,10,16,17。
<ol>
 <li>为识别皮层层，可在受试者执行被动注视任务期间，呈现全视野黑色屏幕并闪烁100毫秒白色后返回黑色，测量诱发反应电位。此序列为1次试验，重复200次。</li>
 <li>Plexon多通道采集处理器通过National Instruments PCI板将所有连续数据信号直接保存至记录计算机。数据保存完成后，开始对信号进行电流源密度分析处理。</li>
 <li>使用Plexon提供的软件校正工具FPAlign，校正由前置放大器头级和预放大板滤波器引起的LFP信号时间延迟。</li>
 <li>此时通过Neuroexplorer将数据传输至MATLAB。对每个LFP通道使用截止频率为0.5 Hz和100 Hz的标准高通与低通滤波器进行滤波。每个电极触点滤波后，识别各次试验并进行跨试验平均，以获得每个电极触点的平均LFP时间序列。然后将各触点组织为一个矩阵，其中LFP振幅为时间的函数。</li>
 <li>在MATLAB工作区输入CSDplotter，运行iCSD（文本叠加：电流源密度）工具箱。由于连续数据的采样频率为1 kHz，将dt参数设为1 ms。接着将皮层电导率值设为0.4 S/m（此值近似电流源密度单位为纳安每立方毫米），并将电极位置设为[0.1:0.1:1.6]的向量以反映触点数量。所有参数设置完成后，点击“Run This”。</li>
 <li>在CSDplotter界面中查看CSD分布图，并将其粘贴至新图像。可使用MATLAB中的常见函数（如imagesc）绘制层分布图，并可应用多种平滑算法和归一化程序来呈现CSD数据，以及比较不同时间点和实验会话间的层识别结果。</li>
 <li>为识别伴随第4层底部出现的源-汇构型的极性反转，首先通过层状CSD分布图验证颗粒层中是否存在主要的电流汇。在CSD图中定位由负极性驱动的电流汇，然后计算颗粒层电流汇的质心。</li>
 <li>通过分析获得一个质心，该质心对应电流汇最大时的触点编号和时间。具有电流汇质心的触点作为颗粒层的参考点（0 μm）。分析参考点上下所有触点，并将其归入以下三个可能的层之一：上颗粒层、颗粒层和下颗粒层。</li>
 <li>通过随机打乱电极位置（保持时间域不变）来验证颗粒层电流汇的有效性。打乱CSD矩阵后，再次进行质心分析。作为皮层深度函数的电极触点打乱应消除任何层特异性。</li>
</ol>
5. 单个神经元的鉴定与感受野定位
使用U-Probe在分离和记录多个单个神经元信号方面已取得极大成功。在一次典型的记录中，通常可获得6至10个分离良好的单个神经元信号以及14至16个局部场电位信号。与单个电极相比，使用U-Probe寻找单个神经元信号也更为可靠。即使使用所有必要的硬件来精确推进16根电极，其在皮层层级上对神经网络群体的探索精度也无法与U-Probe相比。最后，我们通常可以使用同一根U-Probe进行30至40次穿刺记录。
<ol>
 <li>为寻找感受野，首先在可能含有感受野位置的显示器上呈现反向相关刺激。该刺激由四个方向光栅组成，方向分别为 0、45、90 和 135 度。</li>
 <li>对放电率图谱进行聚类分析以定位感受野。首先，计算每个时间延迟下最大放电率位置及其质心。然后，计算质心与这些最大放电率位置之间的距离。针对每个神经元，独立计算在 40–120 ms 传导延迟范围内、以 5 ms 为间隔的各个空间位置的放电率图谱。</li>
 <li>计算所有时间延迟下质心与周围最大放电率点之间的总距离。感受野对应于使该距离最小的时间延迟。</li>
 <li>在为每个细胞确定感受野后，呈现一个大于所有感受野位置的反向相关刺激，覆盖记录神经元群体中所有重叠的感受野区域。可通过实时放电率图谱判断是否已正确识别感受野位置。</li>
 <li>最后，剔除放电反应突然变化的单个单元，仅保留放电率稳定的单元用于后续分析。此外，选择信噪比最佳的记录位点。</li>
</ol>
6. 典型结果：初级视觉皮层各皮层中单个神经元和局部场电位的记录
使用层状电极进行分析时，最重要的步骤之一是可靠地识别皮层各层，并在数小时乃至多个记录时段内验证该识别的准确性。因此，我们测量了局部场电位（LFP）在全视野闪光刺激下跨层状电极接触点的诱发电位（ERPs）（图3a）。图3b展示了一个示例，说明了为计算电流源密度（CSD）以识别皮层各层所需获取的信息类型。随后，我们采用对LFP时间序列的CSD分析，识别出在第4层底部伴随出现的极性反转以及相应的“电流汇-电流源”（sink-source）构型。图4a展示了CSD分析结果，其显示了皮层深度方向上随时间变化的皮层分层定位——颗粒上层（SG）、颗粒层（G）和颗粒下层（IG）的位置在记录开始后四小时仍保持稳定。图4b包含代表分配至特定皮层的电极接触点平均值的CSD轨迹——在此示例中，颗粒层在约50 ms时表现出明显的CSD振幅下降。该分析被用作参考，以将位于颗粒层上方和下方的电极接触点分别分配至颗粒上层和颗粒下层（以电流汇质心最大值所在的接触点作为颗粒层的参考位置，定义为0 μm）。
使用层电极进行的另一项关键分析是准确定位和识别神经元的感受野。该步骤对于确定刺激位置至关重要，可使神经元产生最强的反应。图5a展示了初级视皮层（V1）神经元的两个感受野图示例。这些图的原点为注视点，即在黑色计算机屏幕中央显示的一个小白色圆圈。图中的颜色表示各个神经元对动态反相关刺激的放电率。我们利用这些信息为特定实验（例如正弦光栅刺激）确定刺激的位置。所呈现的刺激范围大于平均感受野尺寸，以便覆盖所有同时记录的神经元的感受野位置。
在确定皮层各层并刺激位于最佳感受野位置后，我们即可开始实验方案，向动物呈现各种视觉刺激，同时让其执行注视或辨别任务。实验结束后，我们进行 spike-波形分析，以分离出在同一通道记录到的单个神经元信号。掌握这一过程通常需要一定时间，且随着新的分析软件和技术的不断出现，该方法也在持续改进。图5b展示了使用Plexon公司的Offline Sorter软件后可能得到的一类输出结果。通过该软件，单神经元信号的分离依赖于对波形特征的视觉检查，依据包括第一和第二主成分的权重、spike宽度、波谷和波峰特性，识别出不同的聚类簇。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig1.jpg" alt="用于神经接口研究的电极阵列示意图，标注间距与直径测量值。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 多触点层状电极 使用多触点层状电极，我们同步记录了来自V1皮层各层中单个分离神经元和局部场电位（LFP）单元的放电活动。每个U-Probe包含16个等距（100 μm）排列的电极触点，总跨度为1.6 mm。每个电极触点直径为25 μm，由铂铱合金制成。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig2.jpg" alt="高压反应器组件装置；包括夹具、密封件、杆件；化学实验组装示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2. NAN网格结构 NAN微驱动系统相较于传统的螺钉驱动微驱动系统，提供了更高的稳定性和精确性。每组电极可在XY平面内独立操控，操控范围由用户自定义。每组电极在Z方向上也可在用户设定的工作深度（最大可达100 mm）内独立移动，移动速度范围为0.001 mm/sec至0.5 mm/sec，分辨率为1微米。(a) 4通道基座，(b) NAN腔体，(c) 间距为1 mm的网格，(d) 1-4个螺钉微驱动装置，(e) 1-4个导引管（直径500 μm，长度裁剪至约5-7 cm），(f) 1-4个微驱动塔架，以及(g) 完整的NAN系统与圆柱基座。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig3.jpg" alt="ERP 实验范式示意图及局部场电位（LFP）振幅结果；时间-刺激起始，认知反应分析。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3. 诱发电位范式与局部场电位（LFP）时间序列 (a) 为识别皮层层级，我们在猴子执行被动注视任务时记录诱发电位（ERP），期间呈现全视野黑色屏幕，以约 1 Hz 的频率短暂闪烁白色（100 ms），随后恢复为黑色。(b) 使用层状 U 探针记录的 LFP 信号经处理后，获得每个电极触点的 ERP 轨迹。在所有实验中，通过 ERP 轨迹中反应振幅的“汇驱动”（sink-driven）极性反转，以及在第 4 层底部出现的“汇-源”（sink-source）构型伴随的极性反转，确定颗粒层的位置。虚线框标示了极性反转发生的时间段。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig4.jpg" alt="皮层深度CSD分析图；用于随时间评估源-汇关系的彩色图谱与线图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4. 利用电流源密度分析进行层识别（a） 基于2的电流源密度分析nd 局部场电位时间序列的空间导数被用于识别颗粒层基部伴随的极性反转及相应的电流流入-流出构型。我们评估了皮层分层识别在时间上的稳定性（从左至右）。在这些示例中，电流流入区（蓝色）代表颗粒层，范围约为 ~ 400 μm. (b) 每个图下方的CSD迹线表示分配给特定层的那些电极接触点的平均CSD。这使我们能够确定初始电流 sinks 的精确时间（在这些示例中约为50–60 ms）。CSD迹线的包络线表示标准差，黑色条形表示闪光刺激的持续时间（100 ms）。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig5.jpg" alt="神经活动热图与发放率的主成分分析；单神经元波形分析示意图。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 峰电位分类与感受野定位 (a) 首先计算半个视觉度并将其加倍。随后，在CRT显示器上以0、45、90和135度方向的条栅作为反向相关刺激，分块呈现。对于每个空间位置，在刺激呈现后40至120毫秒之间，以5毫秒为间隔独立计算每个神经元的发放率。计算最大发放率，然后计算每个时间延迟下的发放率重心。接着，在每个延迟时间点计算重心与相邻发放率位置之间的距离。选择距离最小时对应的时间延迟作为感受野。 (b) 使用离线分类软件程序（Plexon）分析峰电位波形特性，如峰值高度、谷值深度、峰谷时间间隔、峰或谷出现的时间等。根据相似特性对峰电位进行分类，直至来自单个神经元的波形聚类且不与其他神经元波形重叠。
<img src="/files/ftp_upload/2806/2806fig6.jpg" alt="随机化CSD分析，基于时间、颜色编码的神经元活动变化图，显示数小时内变化。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 随机化CSD图谱。 与图3a采用相同表示方法，但我们执行了一项随机化处理，即随机混合电极接触位点，重新构建一个新的CSD矩阵。该分析通过随机打乱电极位置（保持时间域不变）以更好地验证颗粒层电流汇。从这些随时间展示的示例可见，当电极接触点随皮层深度随机化后，任何层状特异性均被破坏。

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</ol>

未声明任何利益冲突。

多通道记录已成为分析皮层神经网络如何编码刺激信息的标准方法。随着电极技术的最新进展，层状电极的应用使得对局部皮层环路进行前所未有的精细表征成为可能。尽管多电极记录能够提供有关神经群体动态的有用信息，但多个层状电极可实现更高的空间分辨率，并提供更多关于神经元具体位置的信息。由于皮层在结构上分为具有不同解剖学输入和输出的层次，这就引发了一个问题：感觉信息在这些不同层次中是如何被差异性处理的。
我们介绍了一种利用多触点层状电极记录初级视皮层（V1）中不同皮层层级的局部神经网络活动的新方法。重要的是，我们还实现了一种在诱发反应范式下分析局部场电位以识别皮层层级的方法。此外，我们提供了来自感受野定位程序和峰电位波形分析的详细结果。
我们认识到，层状电极并非没有局限性，其中最显著的是记录的稳定性。我们建议使用该技术的研究人员耐心推进电极，并在推进后给予足够时间让大脑状态趋于稳定（我们通常在最后一次推进后记录45分钟至1小时）。在此期间，我们将运行大量眼动校准、感受野定位和诱发电位范式。
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<table><tbody><tr><td>纳米微驱动系统</td><td>NAN Instruments</td><td>NAN-S4</td><td>图2。使用U-Probe需要定制夹具。除U-Probe外，所提及的所有部件均由NAN Instruments提供。</td></tr><tr><td>螺钉微驱动器</td><td>MIT机械加工车间</td><td></td><td>任何能够将导管固定到NAN网格上的装置均可使用。</td></tr><tr><td>不锈钢导管</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>B00137QHNS (1) 或 B00137QHO2 (5)</td><td>这些导管长度为60英寸，需在实验室中使用Dremel手钻按所需尺寸切割。</td></tr><tr><td>Plexon U-Probe</td><td>Plexon</td><td>PLX-UP-16-25ED-100-SE-360-25T-500</td><td>详见Plexon官网提供的U-Probe技术规格：&lt;a href="http://www.plexon.com"&gt;www.plexon.com&lt;/a&gt;，另见图1。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表1。&lt;/strong&gt;硬件。</td></tr><tr><td>NAN软件</td><td><a href="http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NAN Instruments</a></td><td></td><td>计算机接口需要额外的串行端口，以兼容Plexon系统和NAN硬件</td></tr><tr><td>Offline Sorter、FPAlign、PlexUtil、MATLAB程序</td><td><a href="http://www.plexon.com/downloads.html#Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Plexon</a></td><td></td><td>位于&amp;rsquo;安装包&amp;rsquo;栏目下</td></tr><tr><td>Neur&amp;#8211;xplorer</td><td><a href="http://www.neuroexplorer.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NeuroExplorer</a></td><td></td><td>位于&amp;rsquo;资源&amp;rsquo;栏目下</td></tr><tr><td>CSDplotter 版本 0.1.1</td><td><a href="http://arken.umb.no/%7Eklaspe/user_guide.pdf" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Klas H. Petterson</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表2。&lt;/strong&gt;软件。</td></tr></tbody></table>

使用多通道层电极记录技术研究局部神经网络处理

Examining Local Network Processing using Multi-contact Laminar Electrode Recording

皮层各层是遍布新皮层1-4的普遍结构，由高度重复的局部神经网络组成。近年来，我们对不同皮层各层神经元响应特性的差异已有显著进展5-8，但关于神经元群体是否以及如何以特定分层的方式编码信息，仍有许多问题有待探索。
现有的多电极阵列技术虽然能够有效测量大脑皮层表面数毫米范围内神经活动的响应，但并不适用于研究皮层层状环路的问题。在此，我们介绍了利用多触点层状电极（图1；Plextrode U-Probe，Plexon公司）记录初级视皮层（V1）各皮层中单个神经元及局部场电位（LFPs）的实验设置与记录方法。
所包括的方法有记录装置的构建、皮层各层的鉴定以及单个神经元感受野的鉴定。为了鉴定皮层各层，我们使用全视野闪光刺激，测量局部场电位（LFP）时间序列的诱发电位（ERPs）。随后进行电流源密度（CSD）分析，以识别伴随第4层底部出现的源-汇构型的极性反转（汇位于第4层内，后文称颗粒层9-12）。电流源密度分析具有重要意义，因为它可提供跨膜电流流动的位置、方向和密度的指标，使我们能够在单次穿刺中精确定位电极，以记录所有皮层层次的活动6, 11, 12。

理解皮层环路的一个基本问题是不同皮层中的网络如何编码感觉信息。本文介绍了利用多触点层状电极记录单个神经元放电和局部场电位的电生理学技术，并展示了用于识别皮层分层的分析方法。

皮层各层是遍布新皮层的普遍结构，由高度重复的局部网络组成。近年来，该领域取得了显著进展……

本实验的总体目标是描述一种方法学，该方法将使我们能够研究初级视皮层不同皮层层中的单个神经元以及局部场电位如何编码感觉信息。该实验流程首先介绍计算机控制的微型驱动系统的构建，以及在初级视皮层记录过程中使用多触点层状电极的方法。下一步是在电极推进至目标脑区后，进行诱发电位范式记录。随后采用电流源密度分析，根据极性反转并结合同步源构型来确定皮层分层。该实验流程的最后一步是进行感受野定位，并分析神经元活动在视觉刺激下的差异。最终可以获得显示感觉信息编码在不同皮层出现特异性变化的结果。大家好，我叫Sarah Eagleman，是休斯顿德克萨斯大学医学院的一名研究生。与现有的多电极阵列等方法相比，该技术的主要优势在于，U型探针可在单次插入过程中同时记录跨越数毫米皮层范围的神经活动。大家好，我叫 Brian Hansen。我是休斯顿德克萨斯大学医学院的一名研究生。该方法可以解答神经科学领域中的关键问题，探讨信息是否以及如何以特定皮层层级的方式进行处理。首先，准备构建命名电极驱动组件所需的工具和部件，包括导管、导丝、完整的Dremel工具套装、命名工具和零件，以及U型探针。测量导管的长度，确保将其连接到记录装置后，能够刚好放置在硬脑膜上方而不对其造成损伤。接下来，在测量记录腔深度后，根据测得的长度（约5至7厘米）切割导管。在切割导管时需谨慎操作。尽量确保无金属碎片进入管内。使用比导管内径更小的硬质金属丝清除管内的任何金属碎片。然后，将名称网格放入名称底座中。拧紧夹紧螺钉和网格螺钉。然后确定记录的目标区域，并将微驱动塔定位在该区域上方。确定目标区域后，将导管从网格底部推进，直至其伸出颅腔约一到两毫米。接下来，在每个NA微驱动装置的塔架上安装两个夹具。上方的夹具由电机驱动，而下方的夹具可以固定不动或处于松动状态。上方的夹具连接至U型探针的加固管。将底部夹具连接到导管上，并在导管连接处涂抹少量瞬间胶以固定导管位置。这两个夹具可为系统提供稳定性和精确性。仔细对准U形探针的尖端与导管顶端，然后将U形探针穿过导管，直至能够将塔体固定到主底座上。使用拇指螺丝调节塔的位置，确保U型探针或导管上无额外张力。将命名系统放置在圆柱底座上，并将电机电缆连接至相应的塔。若使用多个塔，可使用颜色编码的扎带以区分不同电机电缆和塔。使用命名软件程序开始推进U型探针，可通过设置目标位置使U型探针自动推进至该位置，或通过按住命名软件界面手动推进U型探针，确保探针尖端至少有10毫米穿过导管并超出命名腔末端。在将U探针连接到植入式记录室之前，将其置于甲基侧链活化的醛溶液中灭菌20至30分钟。随后，用无菌水冲洗U探针和名称基座。通过回撤U探针，使其尖端刚好位于名称软件中的导管内部，以确定名称软件的位置。点击将所有位置归零。将命名基座连接到植入的记录室上，并拧紧全部四个螺丝。然后根据记录室侧面的定位销对齐基座。再次拧紧所有四个螺丝，并确保名称底座已牢固地固定在记录室上。为准备推进记录，根据接地和参考说明，将U探针接地并视为浮地状态。这可通过放置连接的跳线实现。将头部电极固定在U型探针连接器的底部接头上，然后连接放大器电缆并接地。以快速而有力的方式将U型探针初始推进约1至2毫米。将速度参数设置在每秒0.1至0.2毫米范围内，深度步进设置为0.2至0.3毫米。这些数值可确保U型探针能够干净地刺穿硬脑膜，这是记录过程中的重要第一步。穿过硬脑膜后，将推进速度降低至0.50至0.1毫米每秒，并将深度步进减少至0.5至0.1毫米。目标是以尽可能平稳且缓慢的方式推进U型探针，以避免损伤任何组织。探针进入大脑的指征之一是局部场电位（LFP）振幅发生变化，同时噪声水平降低。为确认电极已贯穿所有皮层，可通过测量其对全视野白光闪光刺激的振幅变化来验证。LFP振幅随时间的变化构成了诱发电位分析的基础。该分析为识别皮层各层提供了依据。在受试者执行被动注视任务期间，呈现一个全视野的黑色屏幕，屏幕闪烁100毫秒白光后恢复为黑色，测量诱发反应电位。此序列为一次试验，共重复200次。多通道采集处理器通过国家仪器公司PCI板将所有连续数据信号直接保存至记录计算机。数据保存后，开始对信号进行处理，以进行电流源密度分析。使用 Plex on 提供的软件校正工具 FP align，校正由前置放大器阶段和预放大板中的滤波器引起的局部场电位信号的时间延迟。此时，通过 Neuro Explorer 将数据传输至 MATLAB。每个LFP通道使用标准的高通和低通滤波器进行滤波，截止频率分别为0.5赫兹和100赫兹。在对每个电极触点滤波后，识别每个试验并跨试验取平均，以获得每个电极触点的平均LFP时间序列，然后将每个触点整理成一个矩阵，其中LFP幅度为时间的函数，在MATLAB中通过在工作区中输入CSD plotter运行ICSD工具箱。由于连续数据的采样频率为1千赫兹，将DT参数设置为1毫秒。接下来，将皮层电导率值设置为 0.4 西门子每米，该数值可近似表示电流源密度，单位为纳安每立方毫米；并将电极位置更改为从 0.1 开始、以 0.1 为步长、至 1.6 结束的向量，其中 1.6 为接触点总数。当所有参数输入完成后，点击运行此程序。在 CSD 绘图界面中查看 CSD 分布图，并将其粘贴至新图中。可以使用 MATLAB 中的常见函数（如 image SC）来绘制层析轮廓，并应用各种平滑算法和归一化例程，以呈现 CSD 数据，并对不同时段和实验会话之间的分层识别进行比较。为了识别伴随第四层底部源-汇构型出现的极性反转，首先需确认颗粒层中存在主要的汇（sink）。利用层状 CSD 轮廓，在 CSD 图中定位由汇驱动的负极性区域。然后计算颗粒沉降物的质心。通过分析可获得一个 A OID，其包含同步性最大时的接触次数和时间。与同步中心的接触作为颗粒层在零微米处的参考。分析参考位置上方和下方的所有接触点，并将其归入三个可能的层之一：浅层（supra-granular）、颗粒层（granular）和深层（infra-granular）。通过重排电极位置以打乱空间信息，同时保持时间域不变，从而验证颗粒层作为电流源汇的有效性。重排后，利用CSD矩阵进行OID分析。同样，随着皮层深度变化而随机化电极接触位置应会破坏任何层状特异性。为确定感受野，首先在可能定位到感受野的显示器区域呈现反相关刺激。该刺激由四个方向梯度组成，分别为 45、0、90 和 135 度。对放电率图进行聚类分析以定位感受野。首先，计算每个时间延迟下的最大放电率位置及其质心。然后计算Centro与这些最大放电率位置之间的距离。针对每个神经元，独立计算在40至120毫秒传导延迟范围内、以5毫秒为间隔的各个空间位置上的放电率图谱。计算OID与所有时间延迟下周围最大放电率点之间的总距离。使该距离最小的时间延迟即为感受野所在的时间延迟。当找到每个细胞的感受野后，呈现一个反向相关刺激，该刺激范围需大于所有感受野的位置，并覆盖记录细胞群体中的全部感受野。可利用实时发放率图来判断是否已正确识别感受野位置。最后，使用 Plexon 的离线分类程序对动作电位波形进行分类，该程序基于主成分、峰宽、谷值和峰值特性等参数进行波形聚类。务必移除那些反应突然变化的信号单元，仅保留具有稳定放电率的单元用于此处所示的进一步分析。以下示例说明了CSD分析如何根据皮层深度随时间定位皮层各层：即使在记录开始四小时后，浅层、颗粒层和深层的位置仍保持稳定。CSD迹线代表分配给特定皮层层的电极接触点信号的平均值。在此示例中，颗粒层在约50毫秒时的CSD振幅明显下降。使用层电极时另一项关键分析是准确定位和识别神经元的感受野。这些图的原点为注视点，即显示在黑色计算机屏幕中央的一个小白圆点。这些图中的颜色表示每个神经元对动态反向相关刺激的放电率。该图展示了在同一通道上分离出的两个动作电位波形示例。通过主成分分析和动作电位波形特征进行了聚类分析。平均锋电位波形以实线表示，标准差以虚线表示。在进行这些操作时，重要的是要记住仔细推进电极，并在每次推进后留出足够时间，使脑组织充分稳定。通常在按照此步骤操作后，于最后一次推进后的30至45分钟开始记录。其他光谱技术，如局部场电位功率（LFP Power）和峰电位场同步（Spike Field synchronization），可用于研究皮层内及皮层间网络结构。

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使用多通道层电极记录技术研究局部神经网络处理

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