计算机辅助多电极膜片钳系统

该程序的总体目标是在全细胞模式下对多达 12 个细胞进行膜片钳记录。这是通过首先标记每个感兴趣细胞的位置并为每个细胞分配一个移液器来实现的。第二步是找到每个移液器的吸头，并自动将移液器移动到其分配的细胞旁边。

接下来，一次用一根移液器接近每个细胞。为了与细胞膜建立紧密的密封，最后一步是破坏细胞膜并进行全细胞记录。最终，计算机辅助多电极膜片钳记录用于以高分辨率显示小神经元电路的网络特性。

与手动膜片钳等现有方法相比，该技术的主要优点是，网络中可以观察到的连接数随着所记录神经元数的平方而增长。该技术的视觉演示很重要，因为膜片钳步骤可能难以学习，因为它们需要执行的复杂性和速度。通过放置一个脑切片来开始此过程，该脑切片的感兴趣区域位于显微镜位移范围的中心。

接下来，确定感兴趣的细胞。然后根据显微镜坐标系保存细胞的位置。图形界面将显示选定的细胞以及微量移液器以进行全局概览，软件将在细胞位置上添加一个标记，该标记将叠加在图像上。

此外，还会捕获细胞的图像以供将来参考。选择感兴趣的细胞后，通过在图形界面中设置分配控件来分配将用于记录单个细胞的移液器。通过选中复选框 show final positions 来可视化最终配置的预览。

现在用细胞内溶液准备移液器并将它们放在支架上。将头部载物台放在固定装置中，但不要向前滑动。为避免移液器吸头接触浴槽，请启用正压控制并选择所有移液器。

为确保吸头保持清洁，请轻轻地将每个头部平台滑入到位。接下来，在按住按钮 A 的同时按下 R 两个按钮，将显微镜定位到切片上方两毫米的焦点的中心位置，使用从上一个实验中存储的每个纵器的相应位置，按住按钮的同时按住按钮 A.At 此时，应该有一个明显的移液器阴影，或者沿移液器轴的小幅移动就足够了来观察它。移液器形状的细微差异必须手动进行补偿。

接下来，聚焦移液器吸头。然后将尖端放在视频显示屏的红色中心点上。在不移动显微镜的情况下，按住控制器的按钮 C，按下 Z 按钮，通知软件移液器位于显示屏的中心。

找到单个移液器吸头后，将该移液器向后发送，以便在按住按钮 a 的同时按下 L one 按钮来定位下一个移液器。一旦所有移液器吸头都被精确定位，并且每个移液器都归属于一个细胞。只需右键单击图形表示窗口中细胞组的中心，然后在弹出菜单中选择 cluster 选项，即可自动将移液器放置在靠近各自细胞的位置。

在群集选项窗口中，选择此时要放置的所有移液器，然后单击选中的移液器的 go。对每个感兴趣的细胞簇重复此过程。要执行最终方法，请将移液管相对于细胞的位置指定为在移液管轴上距离细胞 200 微米，在垂直方向上距其上方 200 微米，这足以将移液器吸头保持在组织外。

然后等待移液器的定位完成。然后在按住按钮 C 的同时按下 R one 按钮，将显微镜移向移液器，通过在视频显示中的任意位置将显微镜聚焦在其尖端上，并在按住按钮 C 的同时按下 B 按钮来重新校准每个移液器位置，A 方格应短暂出现，指示移液器的已识别位置。如果位置不正确，请将尖端放在视频显示屏的中心点上，然后在按住控制器的按钮 C 的同时按下 Z 按钮。

现在确认当前移液器的目标细胞已正确标记，主动标记。否则，移动显微镜以将感兴趣的细胞与中心红点匹配，在按住按钮 C 的同时按下 Y 按钮标记细胞，然后在按住按钮的同时按下 L 两个按钮 C.To 将移液器放置在距离其指定细胞 200 微米的位置，显微镜将自动移动到相应的位置。调整移液器位置，使其与红点匹配。

然后通过按下 R one 按钮调整移液器偏移。按住按钮 x 时。在按住按钮 x 的同时按下 L one 按钮激活测试脉冲。

之后，慢慢地将移液器移动到其属性的单元中。在观察到细胞膜表面形成凹坑后，按住按钮 Z 的同时按下 Y 按钮施加短暂的负压脉冲，以使施加的压力到达细胞。此时应通过在按住按钮 x 的同时按下 L 两个按钮来建立大约负 65 毫伏的保持电位。

一旦每个细胞形成千兆密封，就开始通过施加负压来破坏膜。接下来，使用刺激采集系统进行记录。一次在单个细胞上应用脉冲或脉冲序列，并观察剩余细胞的响应以映射这些记录的细胞之间的连接。

记录完成后，右键单击表格单选按钮，将移液器从组织中缓慢退出。选择 resete 移液管 500 微米，使移液管沿其轴后退一小段距离。然后观察细胞从移液管完全回撤

将定位速度设置为快速并重复相同的作，但选择 全部 选项。轻轻滑出头部载物台并从支架上拧下移液器，取出用过的移液器。以下是在单个实验中映射的直接突触连接网络的示例。

这三个连接图是记录在第 5 层的 12 个寄联金属单元的集合，具有各自的体细胞间距离。这是叠加在记录的寄生金属细胞形态学染色上的连接图。此图显示了公共邻域效应。

蓝色列表示同时连接到采样网络中至少一个其他神经元的神经元对。图表 A 显著增加了互连的可能性。这里显示了在采样网络中，共享多个共同邻居的神经元对偶然出现的频率高于预期，神经元对内的连接概率随着付款人共享的共同邻居数量的函数而增加。

这些属性反过来又产生了小型世界集群网络。该图显示了 Martin nty 细胞募集的量化。这是红色的副金属细胞的图形表示，该细胞在蓝色的 Martin nty 细胞上形成突触，而 Martin nty 细胞又在第二个细胞旁金属细胞上形成突触。

在黑色 supra 阈值中，对旁金属细胞的刺激导致 Martin nty 细胞的募集。通过整合促进兴奋性突触后电位，募集的 Martin nty 细胞然后抑制第二个副金属细胞。该图表示对越来越多的膜片钳准金属单元的刺激以及对另一个准金属单元的影响。

以下是从副金属细胞记录的平均抑制性突触后电位，作为附近受刺激的其他副金属细胞数量的函数。当刺激 9 个或更多寄生金属细胞时，局部回路中 DYS 突触抑制的振幅趋于饱和，并且随着贴金属细胞数量的增加，接受 DYS 突触抑制的细胞比例迅速上升到 1。在尝试此过程时，重要的是要保持移液器尖端的清洁，并通过在接近阶段避开血管和其他细胞来最大限度地减少组织变形。

遵循此程序，可以采用其他方法（例如光刺激）来解决其他问题，例如另一种细胞类型对斑片夹细胞的创新。观看此视频后，您应该对如何加速和执行多个神经元的膜片钳程序有很好的了解。