细胞外囊泡摄取实验：利用三维荧光成像技术可视化与定量细胞摄取细胞外囊泡的方法

为了促进细胞间通讯，细胞会分泌细胞外囊泡（EVs）——由脂质膜包裹的纳米级结构。EVs 可携带多种生物 cargo，包括大分子和代谢物，并将其递送至受体细胞。

为了利用共聚焦显微镜观察细胞对细胞外囊泡（EV）的摄取，首先获取新分离的EV。这些EV预先用连接荧光探针的抗体进行标记，以便后续易于观察。

向贴壁的受体细胞培养物中加入适量的荧光标记EVs，孵育所需时间。在孵育过程中，部分标记的EVs会浅表性地附着在细胞表面，而另一些EVs则被细胞内化。

加入不同的荧光染料以标记细胞质，有助于区分被受体细胞内化的细胞外囊泡（EVs）与附着在细胞表面的囊泡。将细胞置于共聚焦显微镜下，沿 z 轴在不同焦平面上进行成像，获取贯穿样品厚度的一系列光学切片。

将这一系列光学切片——即 z 轴堆栈——进行整合，以生成高分辨率的三维样本图像。应用虚拟渲染（一种成像后处理技术）来重建细胞表面。

为了区分表面附着的和内化的细胞外囊泡（EV），将其呈现为不同颜色的点。计算细胞体积及细胞内化的EV数量，从而量化每个细胞的EV摄取量。

在35毫升培养皿中加入1毫升培养基，接种4 × 10⁴个PC3细胞。在最佳细胞培养条件下孵育过夜，使细胞贴壁。次日，用外泌体耗尽的培养基洗涤贴壁细胞两次。

使用无外泌体培养基将荧光标记的细胞外囊泡（EVs）稀释至适当浓度后，加入已贴壁的靶细胞中，并在所需实验时间内进行孵育。通过无外泌体培养基洗涤细胞三次以去除未被内化的EVs后，使用1 µg/mL的CMTMR对贴壁细胞的细胞质进行标记，并在最佳细胞培养条件下孵育。

进行活细胞成像时，将制备好的细胞置于载物台培养箱中。根据对照样本设定成像参数，确定目标细胞的深度以及z方向上的层扫范围，以获取三维共聚焦图像。随后，同时对细胞特异性染料和细胞外囊泡（EV）特异性染料设置多z层堆叠图像的采集。

对于图像处理，使用自动图像处理软件。

要构建细胞的虚拟表面，请点击“添加新表面”。要配置虚拟细胞表面，请点击“+ 添加”按钮，并选择“质量”作为“筛选类型”。通过目视检查设定低限的适当阈值，将上限设为最大值，然后点击“完成”按钮。

接下来，为了构建囊泡（EVs）的虚拟点，请点击 “添加新点” 按钮。在 “算法设置” 下，选择 “不同点大小” 和 “最短距离计算”。然后点击 “下一步”，并选择 “通道 1 - Alexa Fluor 488” 作为 “源通道”。在 “点检测” 下输入合适的 “估计 XY 直径” 数值，然后点击 “下一步”。

要配置虚拟EV点，请点击“+ 添加”按钮，并选择“质量”作为“筛选器类型”。通过目视检查设置“下限阈值”，然后点击“下一步”。对于“点状区域类型”，选择“绝对强度”，然后点击“下一步”。

为对EV点状区域进行阈值分割，请输入适当的数值 区域 阈值 通过肉眼观察。选择 直径 从 在……下方 区域 体积 并点击 完成。

要拆分构建表面上内部的成组斑点，请单击已构建的“斑点”，然后进入“筛选器”。接着，单击“添加”按钮，并选择“到表面的最短距离 = 表面1”作为“筛选器类型”。

设置低限的最低阈值和高限的适当值后，单击“复制部分到新斑点”按钮。

为自动计数细胞内的EVs，请点击已构建的“Spots 1 选择”，进入“Statistics”，并导出“Total Number of Spots”中的数值。

为获得细胞数量，单击已构建的'Surfaces 1'，然后转到'Statistics'，从'Overall'中导出"Total Number of Surfaces"的数值。最后，转到'Statistics'下的'Detailed'选项卡以导出体积。