细胞外囊泡摄取测定:一种使用 3D 荧光成像技术可视化和量化细胞外囊泡摄取的方法

为了促进细胞通讯，细胞分泌细胞外囊泡，EV - 被脂质膜包围的纳米大小的结构。EV 携带各种生物货物，包括大分子和代谢物，以将它们输送到受体细胞。

要使用共聚焦显微镜可视化细胞对EV的摄取，首先，取新鲜分离的EV。这些 EV 用与荧光探针结合的抗体预先标记，以便随后轻松可视化。

将足够体积的荧光标记的EV添加到贴壁受体细胞培养物中。孵育所需的时间。在孵育过程中，标记的EV的亚群表面附着在细胞表面，而其他EV则被内化。

添加不同的荧光染料来标记细胞质，帮助区分内化的 EV 和粘附在受体细胞上的 EV。将细胞置于共聚焦显微镜下，沿z轴在不同的焦平面上成像，获取样品厚度上的一系列光学切片。

编译这组光学切片 - z 堆栈 - 以形成高分辨率的三维样本图像。应用虚拟渲染（一种成像后过程）来重建细胞表面。

为了区分表面粘附的 EV 和内化的 EV，请将它们渲染为不同色调的点。计算细胞体积和它们内化的 EV 数量，量化每个细胞的 EV 摄取。

4 x 10⁴ 个 PC3 细胞接种到装有 1 毫升培养基的 35 毫升培养皿中。让细胞在最佳细胞培养条件下粘附过夜。第二天，用外泌体耗尽的培养基洗涤粘附的细胞两次。

使用外泌体耗尽的培养基将荧光标记的EV稀释至适当浓度后，将稀释的EV加入粘附的靶细胞中，并孵育所需的实验时间。通过用不含外泌体的培养基洗涤细胞三次去除未内化的EV后，用1μg/mL的CMTMR标记粘附细胞的细胞质，并在最佳细胞培养条件下孵育。

对于活细胞成像，将制备的细胞放入载物台培养箱中。根据对照样品设置成像参数后，确定目标细胞的深度和z方向的堆叠尺寸范围，以获取3D共聚焦图像。然后，将图像采集设置为同时细胞特异性染料和EV特异性染料的多个z堆叠图像。

对于图像处理，请使用自动图像处理软件。

要构建单元的虚拟表面，请单击"添加新表面"。要配置虚拟单元表面，请单击"+ 添加"按钮并选择"质量"作为"过滤器类型"。通过目视检查将下限阈值定为适当的值，设置上限的最大值，然后单击"完成"按钮。

接下来，要构建电动汽车的虚拟点，请单击"添加新点"按钮。在"算法设置"下，选择"不同的光斑尺寸"和"最短距离计算"。然后，单击"下一步"并选择"通道 1 - Alexa Fluor 488"作为"源通道"。在"点检测"下输入"估计 XY 直径"的适当值，然后单击"下一步"。

要配置虚拟 EV 点，请单击"+ 添加"按钮并选择"质量"作为"过滤器类型"。通过目视检查设置"下限"，然后单击"下一步"。对于"点区域类型"，选择"绝对强度"，然后单击"下一步"。

要对 EV 点的区域进行阈值设置，请通过目视检查为"区域阈值"输入适当的值。选择"区域体积"下的"直径"，然后单击"完成"。

要拆分构建表面内的分组点，请单击构建的"点"并进入"过滤器"。接下来，单击"添加"按钮并选择"到表面 的最 短距离 表面 = 表面 1"作为"过滤器类型"。

设置下限的最低阈值和上限的适当值后，单击"将部分 复制到新点"按钮。

要自动计数单元格内的 EV，请单击构建的"点 1 选择"，转到"统计"，然后从"点总数 "中导出值。

要获取单元格数，请单击构建的"表面 1"，然后转到"统计"并从"整体"中导出"表面总数 "的值。最后，转到"统计"下的"详细"选项卡以导出卷。