植物雌激素雌激素活性筛选的雌激素受体-报告基因活性检测

雌激素是一类类固醇激素，可作为内分泌信号分子，与核受体——雌激素受体β结合，形成雌激素-β受体复合物。

这些配体-受体复合物在细胞质中发生二聚化，形成同源二聚体。形成的同源二聚体进入细胞核，与靶基因启动子内的特定DNA序列——雌激素反应元件（ERE）结合，从而启动转录。

为了测定植物雌激素（即模拟雌激素功能的植物来源次生代谢物）的雌激素活性，首先准备含有报告细胞悬浮于适当培养基中的多孔板。

报告细胞经基因工程改造，可过表达雌激素受体β，并转染了与ERE启动子融合的荧光素酶基因。加入含有植物雌激素的样品溶液并进行孵育。

孵育过程中，植物雌激素会与报告细胞中表达的雌激素受体β结合。结合后，植物雌激素-受体复合物发生二聚化并转入细胞核内。

在细胞核内，二聚体复合物与ERE结合。该结合启动荧光素酶基因的转录，产生荧光素酶。随后，移除培养基并加入含有荧光素酶底物的试剂。孵育以使表达的荧光素酶氧化其底物并产生发光信号。

测定发光强度，以确认样品中化合物的雌激素活性。

涡旋混匀样品。然后，将每份样品各取4 µL加入到496 µL的化合物筛选培养基中，配制成含0.8% DMSO的溶液。

用70%乙醇消毒预热的细胞复苏培养基管的外表面，并将10毫升培养基转移至装有冷冻报告细胞的试管中以解冻细胞。盖紧报告细胞试管，置于37摄氏度水浴中5至10分钟。

从水浴中取出细胞后，轻轻翻转离心管数次以打散细胞团块，形成均匀的悬液。然后，用70%乙醇清洁离心管表面。

使用多通道移液器将100微升报告细胞悬液加入96孔板的每个孔中。然后，将100微升样品以每组三个复孔的方式加入相应的孔中。将板在37°C和5%二氧化碳条件下孵育22至24小时。

在平板培养即将结束前，从冰箱中取出检测底物和检测缓冲液，置于低光照区域，待其平衡至室温。然后，轻轻倒置每支试管以混匀溶液。

在培养板孵育即将完成前，将检测试剂缓冲液的全部内容物倒入检测底物管中，以配制荧光素酶检测试剂。轻轻混匀试管，避免产生气泡。

将样本板中的内容物弃入适当的废液容器中，并轻轻在干净的吸水纸上拍打，以去除孔中残留的液滴。每孔加入100 µL荧光素酶检测试剂，将检测板在室温下静置15分钟。然后，使用96孔板读数型光度计定量检测发光信号。