雌激素受体报告基因活性检测筛选植物雌激素雌激素活性

雌激素是类固醇激素，充当内分泌信号分子并与核受体——雌激素受体β结合，形成雌激素-β受体复合物。

这些配体受体复合物在细胞质中二聚化并形成同源二聚体。由此产生的同源二聚体进入细胞核，与雌激素反应元件 ERE（靶基因启动子内的特定 DNA 序列）结合并启动转录。

要确定植物雌激素（模仿雌激素功能的植物来源的次级代谢物）的雌激素活性，首先要将含有报告细胞悬浮在适当培养基中的多孔板。

报告细胞被改造为过表达雌激素受体 β，并转染与 ERE 启动子融合的荧光素酶基因。加入含有植物雌激素的样品溶液并孵育。

孵育过程中，植物雌激素与雌激素受体 β 结合——在报告细胞中表达。一旦结合，植物雌激素-受体复合物就会二聚化并易位到细胞核中。

细胞核内，二聚化复合物与 ERE 结合。结合启动荧光素酶基因转录，产生荧光素酶。接下来，除去培养基并加入含有荧光素酶底物的试剂。孵育以使表达的荧光素酶氧化其底物并产生发光。

测量发光，以确认样品中化合物的雌激素活性。

涡旋样品。然后，将每个样品的 4 微升添加到 496 微升化合物筛选培养基中，以获得 0.8% 的 DMSO 溶液。

用70%乙醇对预热的细胞回收培养基管的外表面进行消毒，并将10毫升培养基转移到冷冻报告细胞管中解冻。关闭报告细胞管，并将其置于 37 摄氏度的水浴中 5 至 10 分钟。

从水浴中取出细胞后，轻轻倒置管数次以分解细胞聚集体，并产生均匀的悬浮液。然后，用70%乙醇清洁管子表面。

使用多通道移液器将 100 微升报告细胞悬液分配到 96 孔板的每个孔中。然后，将 100 微升样品一式三份分配到适当的孔中。将板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 22 至 24 小时。

板孵育结束之前，从冰箱中取出检测底物和检测缓冲液，并将它们放在弱光区域，直到平衡至室温。然后，轻轻倒置每个管子以混合溶液。

板孵育完成之前，将检测缓冲液的全部内容物倒入检测底物管中，以制备荧光素酶检测试剂。轻轻混合管子，以免产生泡沫。

样品板中的内容物丢弃到适当的废物容器中，然后在干净的吸水纸巾上轻轻敲击，以去除孔中的最后液滴。向每个孔中加入100微升荧光素酶检测试剂，并让测定板在室温下静置15分钟。然后，使用 96 孔读板光度计量化发光。