萤光素酶表达的重组病毒的高通量滴定

以下实验的总体目标是使用高通量定量方法估计荧光素酶标记病毒的病毒滴度。这是通过将要滴度的样品的上清液以及病毒标准曲线转移到允许的细胞系上以实现荧光素酶表达来实现的。作为第二步，可以将 RESA zurin 添加到原始样品中，用于评估细胞活力。

接下来，在适当的孵育时间后，将荧光素添加到细胞中，以便通过发光进行定量。结果显示了基于荧光素酶表达的样品中病毒的量。与现有方法（如噬菌斑滴定）相比，该技术的主要优点是可以快速、同时处理大量样品。

这种方法也可以扩展到非咔嗒声荧光素酶表达病毒。由于它不依赖于噬菌斑的形成，因此细胞毒性的读数可以很容易地纳入工作流程，并且在药物筛选中可能很有用。演示该程序的是我实验室的三名研究生 Vanessa Ramia 和 Colin，首先使用 VSP Delta 51 进行感染，表达 96 年的萤火虫荧光素酶。

来自这些板的组织培养板上清液将在滴度测定前 24 小时经过适当的孵育时间后进行滴度测定。在含有 10% FBS 30 毫摩尔堆和 1% 青霉素链霉素 C、2.5 倍 10 至 96 中的第四个细胞的 DMEM 中制备浓度为 2.5 倍 10 至第五个细胞的 Vero 细胞悬浮液。使用微孔板分配器制备细胞悬液的白色固体平底板，用 50 毫升无菌水冲洗管道，清洁微孔板分配器盒。

然后用细胞悬液填充微孔板分配器管线，让 5 mL 细胞悬液流过。选择一个程序，将 100 微升分液分配到白壁 96 孔板分液的每个孔中，并根据需要对其他板重复。此外，在 96 孔透明的白色底板中接种几个孔，以验证细胞健康和密度。

完成后，将细胞冲洗回原始容器中。通过运行 50 毫升 70% 乙醇清洁盒，然后用 50 毫升温无菌水通过管道。之后，将细胞在 37 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 24 小时。

在无血清 DMEM 中制备 VSV Delta 51 的标准曲线，使得转移到 Vero 细胞后每毫升平台单位的最终浓度如下。每板 Vero 细胞制备 50 微升每种浓度，加上额外的 10% 标准曲线可以转移到 96 深孔板中。接下来，在光学显微镜下检查接种在透明底部 96 孔板中的 Vero 细胞，以确认单层至少是 95% 汇合的反式转移。

使用 12 通道多通道移液器将 25 μL 样品上清液滴到位于白壁板中的 Vero 细胞上，将标准曲线的每种稀释液稀释 25 μL 到两个指定柱中的 Vero 细胞中。在室温下以 430 Gs 离心板 5 分钟。然后将板在 37 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳培养箱中孵育 5 小时。

此时，加入的 zurin 量等于含有病毒和细胞的 96 孔板中每个孔中体积的 10%。2 到 4 小时后，使用荧光酶标仪读取并记录信号，使用 530 至 560 进行激发，使用 590 进行发射报告。根据以下公式对样品进行细胞活力测定。

5 小时孵育结束前 30 分钟，准备 Lucifer，在无菌磷酸盐缓冲盐水中制备每毫升 2 毫克的溶液。在用 25 μL Lucifer 孵育 5 小时后，使用集成在光度计中的自动分配器将溶液光照到白色固体板中的每个 Vero 细胞孔中。使用以下参数读取板。

摇晃 5 秒钟，然后等待 30 秒。以适当的固定灵敏度斜杠曝光值读取发光，然后记录并保存量化的生物发光强度。如果使用自动分配器来添加荧光素，栖息荧光素并用无菌水或准确结果灌注线，求解非线性回归以从标准曲线生成希尔方程。

将此公式应用于滴度样品以计算病毒表达单位。此处显示了 VSV Delta 51 的典型标准曲线的结果，或者参数非线性回归分析生成了一个冰雹图，从中可以插值未知的输入形成单位。将通过 Vero 细胞的标准噬菌斑测定获得的病毒滴度与来自相同样品的计算病毒滴度进行比较。

使用高通量荧光素酶测定样品进行滴度测定，该样品源自一项实验，其中使用各种化学物质来增强 VSV Delta 51 和 7 8 6 0 细胞的复制和扩散。图中显示了滴度和病毒表达单位之间的线性相关性，R 平方为 0.8083，Pearsons R 评分为 0.899。从代谢测定中获得的典型细胞毒性数据显示在此处显示了在感染前用化学品处理的 7、8、6、0 细胞。

使用 VSV Delta 51，此处显示了单纯疱疹病毒、牛痘病毒和腺相关病毒获得的典型标准曲线，这些病毒都表达萤火虫荧光素酶。一旦掌握，该技术可用于对化合物库与目标病毒相结合进行高通量筛选，以生成滴度和细胞毒性数据。在尝试此过程时，请务必记住适当稀释标准曲线，因为这对于插入病毒表达单位至关重要。

不要忘记，与活病毒一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如在生物安全柜中工作和佩戴适当的个人防护设备。观看此视频后，您应该对如何使用基于未知病毒表达单位插值中生物发光的荧光素酶转基因测量的高通量定量方法估计病毒滴度有很好的了解。从标准曲线样品中，细胞毒性可以通过适当的活力测定同时确定。