在用水筛查内分泌活动市售的体外式激活生物测定

该标准化程序的总体目标是使用市售的基于受体的细胞测定法筛选水样中的内分泌活性化学物质。这种方法可以帮助回答水质监测领域的关键问题，例如，样品中是否真的存在内分泌活性化学物质？该技术的主要优点是它可以比目前的化学方法更快地分析一组内分泌活性化合物。

该技术可以帮助诊断因内分泌干扰化学物质的存在而引起的水质问题。这种方法可以深入了解水中的污染物，但也可以应用于其他环境基质，例如沉积物和组织。通常，刚接触这项技术的人可能会很困难，因为在使用移液技术时需要高精度。

要开始此程序，请在分析特异性培养基和参考化学品的储备溶液中制备水样，如文本方案中所述。将检测特异性培养基储存在 4 摄氏度下，以便长期储存。接下来，将 15 微升适当的参比化学储备液添加到无菌管中的 285 微升检测培养基中。

通过上下移液混合样品。然后，将 200 微升 5% DMSO 的检测培养基添加到另外 8 个试管中。将 100 μL 等分试样从试管 1 转移到试管 2 中，开始三倍稀释系列。

用移液管将稀释的样品充分混合管 2 中。然后，将 100 微升等分试样从试管 2 转移到试管 3 中。对每个试管继续此过程。

然后，通过将 10 μL DMSO 与 190 μL 检测培养基混合来制备溶剂对照样品。接下来，收集并标记四个新试管。向第一管中加入 95 μL 检测培养基。

然后，加入 5 微升水提取物并充分混合。将 50 微升 5% DMSO 的测定培养基添加到其他三个试管中。然后，通过将 50 μL 溶液从一根试管转移到另一根试管中，进行两次稀释。

首先从低温冰箱中取出一小瓶 ER 或 GR 分裂阻滞细胞。将样品瓶置于 37 °C 的水浴中，轻轻搅拌 2 分钟，快速解冻细胞。然后，用 70% 乙醇对样品瓶进行去污。

将其放入 2 类生物安全柜中。使用无菌技术打开样品瓶，将细胞转移到 10 mL 检测培养基中。以 200 次 g 离心 5 分钟。

离心完成后，使用无菌玻璃移液器吸出上清液。然后，将细胞沉淀重悬于 6 毫升测定培养基中。将 5 μL 细胞悬液与 5 μL Vital 染色液混合。

然后，将等分试样加入计数室中。使用光学显微镜或自动细胞计数仪计数活细胞的数量。然后，估计细胞悬液中活细胞的密度。

必要时稀释，以获得每毫升检测培养基 550， 000 个活细胞的最终密度。首先创建一个板布局，其中包括九点分析特异性校准曲线、QA/QC 样品和每种水提取物的多次稀释。向无重复细胞对照孔中加入 90 μL 检测培养基。

将细胞悬液倒入无菌移液槽中。然后，使用多通道移液器，向其他孔中加入 90 μL 细胞悬液。将 10 微升稀释的样品添加到适当的孔中。

盖上板。然后，将板置于 5°C 的 37% C02 培养箱中 16 小时。孵育完成后，让板平衡至室温。

然后应在没有直射光的情况下进行下一步。根据制造商的说明准备 6 倍加载溶液。然后，向每个孔中加入 20 μL 的上样溶液。

向每个孔中加入 10 μL 细胞活力试剂，以评估稀释水提取物的细胞毒性。用铝胶膜密封板。然后，将板在室温下避光孵育 2 小时。

孵育完成后，将板添加到具有底部读数功能的酶标仪中。测量荧光并按照文本协议中的详细说明分析数据。在这项研究中，分析了四个 24 小时处理过的城市污水复合样品、六个来自南加州淡水系统的地表水抓取样品，以及一个由超纯水组成的现场空白。

在 10 个代表性水样中的 7 个中检测到 ER 活性，而在 4 个中检测到 GR 活性。如需查看雌激素受体和糖皮质激素受体检测的 QA/QC 性能指南，请点击此处。细胞毒性和样品精密度的研究结果完全符合可接受标准，验证了水样的测量结果。

在二级流出物中发现最高的生物测定当量浓度，而发现二级流出物的 GR 活性低于生物测定检测限。同样，大多数地表水样品的 GR 活性没有超过检测限，并且 ER 活性水平远低于二级污水。大多数废水处理厂出水样品显示剂量反应高于 ER 和 GR 生物测定的检测限。

这些样品的平均蓝/绿荧光比的代表性结果，与相对富集因子的关系图，可以在这里看到。如果执行得当，这项技术可以在 24 小时内完成。在尝试时，遵循所有 QA/QC 指南非常重要。

这项技术为管理人员探索监测水中内分泌干扰化学物质的替代方法铺平了道路。不要忘记，使用叠氮化钠可能是危险的。应采取预防措施，例如在功能正常的通风橱中工作。