用于定量脑裂解物中靶蛋白水平的电化学发光测定

要使用电化学发光、ECL、免疫测定法定量检测小鼠脑裂解物中的特定蛋白质，请从多孔测定板开始。

这些井包括导电工作电极和对电极，完成电路。介电层将电极分开，提高了测定灵敏度。

将针对靶蛋白的小鼠一抗单克隆抗体添加到孔中。具有更大结合能力的工作电极有助于抗体固定在它们上。

与含蛋白质的溶液孵育，与孔的剩余结合表面结合，减少背景干扰。

加入小鼠脑核部分裂解物。裂解物中的靶蛋白与单克隆抗体特异性结合。

添加未标记的多克隆抗体，识别并结合蛋白质上的表位，该表位与电极上的一抗单克隆抗体结合。添加用钌络合物标记的特异性二抗，与未标记的抗体结合。添加含有表面活性剂（提供合适的 ECL 生成环境）和三丙胺 TPA 的合适缓冲液。

将多孔板放入 ECL 检测系统中。在电极上施加电位后，与抗体结合的钌络合物被氧化。同时，TPA 被氧化并自发失去质子。

产生的 TPA 自由基将氧化的钌络合物还原至其激发态。弛豫至基态后，钌络合物发射光电探测器检测到的光子。

测量的光强度代表裂解物的特定蛋白质浓度。

从冰箱中取出 96 孔板，并取下箔纸。将抗体包被溶液轻弹到废物容器中，将其从孔中取出。然后，用纸巾轻拍盘子以去除任何残留的溶液。

接下来，向每个孔中加入 125 微升封闭溶液。然后，再次用胶箔密封板。将板放在轨道微孔板振荡器上，设置为 800 RPM，并在室温下孵育 90 分钟。

在冰上解冻，一瓶MeCP2或TAT-MeCP2蛋白储备液，小鼠脑裂解物和HDF裂解物。在干净的管中稀释蛋白质储备溶液，如手稿的表2所述。

接下来，稀释裂解物样品。对于小鼠脑裂解物，每25微升裂解缓冲液使用1至20微克。对于HDF裂解物，每25微升裂解缓冲液添加0.25至1微克。

将 96 孔板孵育 90 分钟后，将封闭溶液轻弹到废物容器中，将其从孔中取出。然后，用纸巾轻拍盘子以去除任何残留的溶液。然后，用 150 微升洗涤液清洗板 3 次，加入洗涤液并立即将其取出。

将 25 微升标准品和样品添加到 96 孔板的孔中。密封板并在室温下再孵育四个小时，恒定 800 RPM 摇动。

冰上解冻未标记的检测抗体，多克隆兔抗MeCP2。使用测定稀释剂溶液，以1：6000的比例稀释抗体。当 96 孔板在摇床上完成孵育后，将板轻弹到废物容器中，取出标准品和样品。然后，用纸巾轻拍盘子以去除任何残留的溶液。

加入洗涤液，用 150 微升洗涤液洗涤板 3 次，然后立即将其取出。使用多通道移液器向每个孔中加入 25 微升未标记的检测抗体溶液。密封板并在室温下孵育 1 小时，并以 800 RPM 恒定摇动。

冰箱中获取特异性二抗，并将其放在冰上。在测定稀释溶液中稀释二抗并轻轻混合。

要从 96 孔板中取出游离的未标记检测抗体，请将其轻弹到废物容器中，然后用纸巾轻敲板。如前所述，洗涤板3次后，用多通道移液器向每个孔中加入25微升二抗。密封板并在室温下孵育 1 小时，并以 800 RPM 恒定摇动。

游离二抗轻弹到废物容器中，然后用纸巾轻敲板，然后按照前面所述清洗板三次，以除去游离二抗。

向板的每个孔中加入 150 微升含有表面活性剂的 1X tris 基金读取缓冲液，其中含有三丙胺作为光发生的共反应物。

为避免产生气泡，请使用反向移液技术。将 96 孔板放在带有电化学发光检测系统的微孔板平台上。

使用内置的CCD相机，立即开始采集数据。记录与相对光单位相对应且与光强度成正比的信号计数。