脑组织裂解液中目标蛋白水平的电化学发光检测

使用电化学发光（ECL）免疫测定法对小鼠脑组织裂解液中的特定蛋白质进行定量检测时，首先准备多孔检测板。

孔板包含导电的工作电极和对电极，构成完整的电路。介电层将电极分隔开，提高检测的灵敏度。

将针对目标蛋白的一抗小鼠单克隆抗体加入孔中。具有更高结合能力的工作电极有助于抗体在其表面固定化。

使用含有蛋白质的溶液孵育，结合微孔板剩余的结合位点，以减少背景干扰。

加入小鼠脑核组分裂解液。裂解液中的目标蛋白可特异性结合单克隆抗体。

加入识别并结合电极上与一抗结合的蛋白表位的非标记多克隆抗体。加入用钌复合物标记的特异性二抗，该二抗结合至非标记抗体。加入含有表面活性剂（提供适宜的电化学发光产生环境）和三丙胺（TPA）的合适缓冲液。

将多孔板放入化学发光检测系统中。当电极间施加电势时，与抗体结合的钌复合物被氧化。同时，三丙胺（TPA）被氧化并自发失去一个质子。

生成的TPA自由基将氧化态的钌配合物还原至其激发态。当钌配合物弛豫回到基态时，会发射出一个光子，该光子被光电探测器检测到。 

所测得的光强度代表了裂解液的特异性蛋白浓度。

从冰箱中取出96孔板，移除封口铝箔。通过轻弹将包被抗体溶液 flicking 至废液容器中。然后将板子在纸巾上轻拍，以去除残留的溶液。

接下来，向每个孔中加入 125 µL 封闭液。然后再次用自粘性铝箔密封酶标板。将酶标板置于转速为 800 RPM 的轨道微孔板摇床上，在室温下孵育 90 分钟。

将 MeCP2 或 TAT-MeCP2 蛋白储备液、小鼠脑裂解液和 HDF 裂解液的冻存管置于冰上解冻。按照论文中表 2 的说明，在洁净的离心管中稀释蛋白储备液。

接下来，稀释裂解液样品。对于小鼠脑组织裂解液，每25微升裂解缓冲液中加入1至20微克蛋白。对于HDF裂解液，每25微升裂解缓冲液中加入0.25至1微克蛋白。

96孔板孵育90分钟后，将封闭液弹入废液容器中。然后将板轻轻拍在纸巾上，以去除残留的溶液。随后用150 µL洗涤液洗涤板3次，每次加入洗涤液后立即移除。

向96孔板的孔中加入25微升标准品和样品。密封孔板，并在室温下以持续800 RPM振荡孵育4小时。

将未标记的检测抗体（多克隆兔抗 MeCP2）置于冰上解冻。使用检测稀释液按 1:6000 的比例稀释该抗体。当 96 孔板在摇床上完成孵育后，通过轻弹将板内标准品和样品甩入废液容器中。然后将板在纸巾上轻拍，以去除残留的液体。

用150微升洗涤液洗涤平板3次，每次加入洗涤液后立即移除。使用多通道移液器向每个孔中加入25微升未标记的检测抗体溶液。密封平板，并在室温下以800 RPM持续振荡孵育1小时。

从冰箱中取出特异性的二抗，并将其置于冰上。用检测稀释液稀释二抗，并轻轻混匀。

为去除96孔板中的游离未标记检测抗体，将孔内液体倾入废液容器中，然后将板轻拍在纸巾上。按照前述方法洗涤板3次后，使用多通道移液器向每孔中加入25 µL二抗。密封反应板，并在室温下以800 ×g持续振荡孵育1小时。

通过轻弹将游离的二抗甩入废液容器中，并将板在纸巾上轻拍，然后按照之前所述方法洗涤板三次。

向每孔中加入 150 µL 含有三丙胺作为发光共反应物的 1× 基于 Tris 的含表面活性剂 Gold read 缓冲液。

为避免产生气泡，应使用反向移液技术。将96孔板放置在配备电化学发光检测系统的微孔板平台上。

使用内置的CCD相机，立即开始采集数据。记录与相对光单位相对应的信号计数，该计数与光强度成正比。