定量免疫印迹法检测细胞系作为常规组织样本中生物标志物蛋白定量免疫荧光验证的标准
2019年1月7日
我们描述了使用定量免疫印迹法来验证免疫荧光组织学结合图像分析的方法，以定量福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本中目标蛋白的含量。我们的结果证明了免疫荧光组织学在确定常规活检样本中生物标志物蛋白相对含量方面的实用性。
该方法可通过定量常规处理的活检样本中的生物标志物蛋白，帮助解答癌症病理学领域的关键问题。与传统的免疫组织化学技术相比，该技术的主要优势在于具有客观性、宽广的动态范围，并能够对特定细胞类型中的蛋白质进行定量。某些所谓的生物标志物蛋白的存在或缺失，尤其是这些蛋白在癌症活检标本中的相对丰度，对于特定类型癌症的明确病理诊断具有重要价值。
但它也可用于预测癌症治疗的反应，因此该技术在癌症患者的诊断和治疗中均具有重要意义。本实验方案主要介绍如何利用永生化细胞系中的蛋白质定量来验证基于免疫荧光检测方法的定量特性。但需要注意的是，免疫荧光技术可轻松整合到多重检测体系中，并可应用于原代活检样本。
本实验操作将由技术员 Lee Boudreau 和运营总监 Shakeel Virk 进行协助与演示。两人均来自皇后大学分子病理学实验室。首先，将先前收获的细胞置于 50 毫升锥形管中，在 225 ×g 条件下离心 5 分钟。
弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后，将重悬的细胞在225 ×g 离心5分钟。用10毫升10%中性缓冲福尔马林（NBF）重悬细胞沉淀。
然后将细胞在室温下置于摇床上，以24 RPM振荡孵育过夜。固定细胞后，在225 ×g下离心细胞5分钟。随后弃去上清液，并将细胞重悬于500 µL PBS中。
将细胞转移至1.5毫升微量离心管中，通过离心形成细胞沉淀，随后吸除上清液。向每管含有细胞的样品中加入约500微升1%琼脂糖溶液。
然后，用移液器上下吹打混合物以混匀。待琼脂糖细胞溶液凝固后，向试管中加入一毫升10% NBF。随后，从样品中移除NBF。
使用剃刀刀片切下组织块，并将组织块放入塑料组织包埋盒中。使用自动组织处理机对样本进行过夜处理。随后，采用标准组织学方法将样本包埋于石蜡中。
使用组织芯片仪，从石蜡包埋块中切取两份6毫米的组织芯，并将其插入空的石蜡包埋块中。随后，使用切片机对新构建的细胞系组织芯片（TMA）制备两张组织切片。将切片贴附于组织学载玻片上，并进行脱蜡处理。
首先，将细胞系TMA的两张切片装入自动染色系统中。其中一张切片使用最佳稀释浓度的一抗进行染色，另一张则作为阴性对照切片不加一抗。对两张切片均施加核复染剂和二抗。
染色完成后，加入酪胺信号放大试剂。随后，根据所用荧光染料的适当激发和检测波长，扫描免疫染色切片。使用图像分析软件确定目标细胞区室（细胞核或细胞质），并量化每条样本的平均荧光强度（MFI）。
为了确定哪种细胞系中目标蛋白的表达量最高，将先前制备好的细胞裂解液分装至微量离心管中。然后加入 2.5 µL 的 6x Laemmli 缓冲液，并加入足量 RIPA 裂解缓冲液，使总体积达到 15 µL。接着，将 SDS-PAGE 凝胶上样，包括蛋白 Marker 以及先前制备好的样品。
此后，将上样缓冲液加入空的加样孔中。电泳至蓝色染料迁移至板的底部。完成半干式蛋白转印后，使用刀片将膜水平切割，以分离目标蛋白与对照蛋白。
根据生产商说明书进行封闭和抗体孵育。然后将膜条放入透明塑料袋中。使用P1000移液器将ECL混合液覆盖于膜上。
然后密封袋子，并将膜在室温下避光孵育一到两分钟。接着，将装有膜的塑料袋放入数字成像系统中。利用化学发光和比色法标记检测，对膜进行不同曝光时间的图像采集。
使用图像分析软件或通过肉眼观察，确定哪种细胞系表达的目标蛋白最多。对该细胞系进行系列稀释后进行免疫印迹，然后使用图像分析软件打开曝光图像。利用矩形选择工具选择凝胶的第一道。
然后依次点击分析（Analyze）、凝胶（Gels），并选择第一条泳道。通过将矩形选区工具移动到下一个泳道，重复此过程，依次点击分析（Analyze）、凝胶（Gels），并选择下一条泳道。接下来，依次点击分析（Analyze）、凝胶（Gels），然后绘制泳道（Plot Lanes）。
使用直线工具在每个峰的基部绘制直线，以去除背景噪声。然后使用魔棒工具选择每个峰，并从结果窗口中获取每个峰的条带强度。根据密度测定结果，针对每种一抗绘制条带强度与上样总蛋白量的散点图。
然后，通过最佳拟合直线和肉眼观察，确定每种抗体的线性动态范围所在区间。选择一个能够产生处于线性范围内的条带强度的蛋白浓度，并使用该蛋白浓度对所有细胞系裂解液进行免疫印迹，如前所述。接着，对数字扫描图像进行密度测定，选择每种抗体信号处于先前确定的线性范围内的曝光条件。
此后，计算每种细胞系中目的蛋白条带强度与上样对照条带强度的比值。最后，使用统计学软件对免疫荧光染色图像分析所得数值与免疫印迹所得数值进行 Pearson 相关性检验。本方案用于验证免疫荧光法测定抗凋亡蛋白 Bcl-2 相对含量的能力。
在人扁桃体组织上使用免疫组织染色仪测试了不同稀释倍数的一抗。本实验确定1:50的稀释度为最佳稀释比例，可产生强信号且背景噪声较低。该稀释比例被用于通过免疫荧光法对细胞系组织微阵列（TMA）进行染色，并采用图像分析方法定量由Bcl-2引起的细胞质Cy5信号。
根据所有受试细胞系的免疫印迹结果，Granta-519 中 Bcl-2 的表达量最高。随后通过 Granta-519 裂解液的系列稀释进行免疫印迹，以确定 Bcl-2 及对照蛋白 GAPDH 的线性动态范围。本实验中 Bcl-2 的动态范围为条带强度接近 0 至 7500 单位。
GAPDH 的动态范围为 3000 至 6500 单位。在该线性范围内重复进行免疫印迹实验，并计算每种细胞系中 Bcl-2 与 GAPDH 的比值。
皮尔逊相关性检验表明，免疫印迹的强度比值与定量免疫荧光的强度读数之间存在强烈且正向的相关性。在进行该实验操作时，重要的是要记住对最终的膜进行多个时间点的曝光，以确定最佳曝光时间，使所有条带均处于各自的线性范围内。在验证了免疫荧光实验方案的定量性质后，可将其改进用于多重免疫荧光检测，应用于常规处理的组织样本，以回答诸如目标蛋白在何处表达等临床问题。
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概述
本研究探索了一种通过定量免疫印迹和免疫荧光组织学来量化癌症病理中生物标志蛋白的新方法。通过将图像分析应用于FFPE组织样本，该方法提供了一种评估蛋白质丰度的客观手段，有助于更好地诊断和预测癌症患者的治疗效果。
研究的关键组成部分
研究领域
- 癌症病理
- 生物标志蛋白定量
- 组织学技术
背景
- 生物标志蛋白在癌症诊断中的重要性
- 相对于传统免疫组化的优势
- 与预测治疗反应的相关性
所用方法
- 定量免疫印迹
- 福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织样本
- 免疫荧光与图像分析结合
主要结果
- 证明了免疫荧光组织学在蛋白质定量中的实用性
- 验证了该技术相对于传统方法的有效性
- 展示了如何评估细胞类型中特定蛋白质的丰度
结论
- 该方法为理解癌症病理提供了一种强有力的方法
- 它提高了诊断准确性，并可能有助于个性化癌症治疗
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative immunofluorescence (IF) combined with image analysis provides an objective, high-dynamic-range method for biomarker protein quantification in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. This approach maintains sample structural integrity, enabling cell-type-specific analysis critical for diagnostic and therapeutic decision-making in oncology. Validation against quantitative immunoblotting establishes predictive confidence for translational applications in cancer pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying biomarker abundance in specific cell types within complex tissues.
- Operational Value: Supports biological de-risking through objective, reproducible protein measurement orthogonal to immunohistochemistry.
- Predictive Value: Generates quantitative data for portfolio triage by correlating IF signal with immunoblot-derived linear ranges.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated FFPE-compatible cell line tissue microarray (TMA) standards for IF assay calibration.
- Quantitative Output: Delivers mean fluorescence intensity (MFI) measurements with defined linear dynamic ranges for target and control proteins.
- Scalability: Facilitates multiplexed IF adaptation for high-content screening of biomarker panels in routine tissue samples.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase target validation to preclinical efficacy studies via quantifiable biomarker expression in disease-relevant FFPE models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by establishing correlation between IF and immunoblot quantification across cell line panels.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by permitting cell-type-specific protein quantification in archival tissues.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing a quantitative IF readout validated against immunoblotting, supporting progression from target hypothesis testing to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through quantitative, cell-type-resolved protein measurement in FFPE tissues.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility via TMA-based controls and defined linear ranges for immunoblot validation.
- Analytics: Generates Pearson correlation-derived quantitative outputs that allow cross-platform comparison of IF and immunoblot signals.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating IF in FFPE cell line TMAs prior to application in primary biopsy samples.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification framework for multiplex IF panels in clinical and research oncology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through orthogonal quantification and reduction of mechanistic ambiguity in biomarker assessment.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via defined linear dynamic ranges and automated image analysis pipelines.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling risk-adjusted prioritization based on quantitative, cell-type-specific biomarker data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through translatable quantification from cell line models to patient tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining, image analysis, and quantitative immunoblotting techniques.
- Dependent on instrumentation for tissue processing, microtomy, automated staining, and digital imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of antibody dilution, exposure times, and image analysis parameters for reproducible quantification.
- Involves adaptation considerations when transferring validated IF protocols from cell line TMAs to primary FFPE biopsy samples.
- Includes practical limitations such as the need for empirical determination of linear dynamic ranges per antibody and exposure optimization to avoid signal saturation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:29
Building a Cell-Line Tissue Microarray (TMA)
3:37
Sample Staining by Immunofluorescence
4:27
Quantitative Immunoblotting of Cell Lines
7:48
Results: Immunoblotting Ratios Strongly and Positively Correlated with Intensity Readings from Quantitative IF
9:22
Conclusion
