量化龙脑中的亚细胞泛基蛋白-蛋白酶体活性

该协议旨在有效地量化啮齿动物大脑不同细胞舱中的泛泛蛋白-蛋白酶体系统(UPS)活性。用户能够检查UPS在同一动物中核、细胞质和突触分数的功能,从而减少执行这些复杂分析所需的时间和动物数量。

该协议测量亚细胞蛋白泛化水平和啮齿动物大脑中蛋白酶活性，允许在受试者内部比较泛素蛋白酶体活动如何随细胞活动、学习或疾病而变化。该协议允许从同一啮齿动物大脑收集突触、细胞质和核分数。最大限度地减少损失，它可以通过小组织量和基本的实验室设备进行。

证明这个程序的将是泰勒·麦克法登，一个研究生从我的实验室。开始这个程序与收集和解剖啮齿动物脑组织，如文本协议中所述。确保使用的半球在每个实验组的提取条件下保持平衡。

从零下80摄氏度的冰柜中取出含有一个半球的1.5毫升离心式微管。使用手术刀，将冷冻脑组织转移到两毫升玻璃特氟龙均质器。向特氟隆管中加入500微升的解液缓冲液。

使用 pestle B，用 15 次冲程使同一组织均质，直到不存在可见数量的固体物质。在每个冲程期间使用转弯运动。使用 1，000 微升移液器，将均质样品转移到新的 1.5 毫升微离心管中。

将管子放在湿冰上孵育30分钟。将管子放在微离心中，在4摄氏度的845倍g下旋转10分钟。完成后，通过移液小心地取出上一液，并放入新的1.5毫升微离心管中。

这是细胞质分数。将 50 微升萃取缓冲液添加到产生的颗粒中，然后通过移液重新暂停。不要涡旋颗粒。

将含有再增颗粒的管子放在冰上孵育30分钟。然后在4摄氏度的21，456次g下将管离心20分钟。离心后，通过移液小心去除上经剂，并放入新的1.5毫升微离心管中。

这是核部分。与以前一样，将感兴趣区域的一个半球同质化，除了使用 500 微升的 TEVP 缓冲液而不是解解缓冲液。使用1000微升移液器，将均质样品转移到新的1.5毫升微离心管中。

将样品以1000倍g离心，在4摄氏度下10分钟。收集上流水液，然后使用1000微升移液器将其转移到新的1.5毫升微离心管中。在4摄氏度下，以10，000倍g离心样品10分钟。

丢弃含有核和大碎屑的原始颗粒。将上流液转移到新的 1.5 毫升微离心管中。这是细胞分位。

在颗粒中加入50微升均质缓冲液，然后通过移液重新暂停，直到看不到固体材料。将样品以20，000倍g离心，在4摄氏度下10分钟。将上流液转移到新的 1.5 毫升微离心管中。

这是粗突触体膜分数。要设置测定，将板读卡器预热至37摄氏度，并按住运行。将激发设置为 360 纳米，将发射量设置为 460 纳米。

如果使用的 96 井板清晰，请将光学位置设置为底部。如果使用深色 96 井板，请将光学位置设置为顶部。对动能运行进行编程，每 30 分钟扫描两小时。

将套件中提供的 20S 10X 检测缓冲液与 13.5 毫升超纯水重组。将 14 微升 100 毫摩尔 ATP 添加到现在的 1X 缓冲器中。这显著增强了样品中的蛋白酶体活性，并提高了测定的可靠性。

重组套件中提供的 AMC 标准，并配有 100 微升的 DMSO。在黑暗或低光条件下使用 AMC 标准执行步骤，因为该标准对光敏感。创建从一系列高到低AMC浓度的AMC标准曲线。

此曲线将用于板读卡器校准和分析均质样品中的蛋白酶体活性。用 65 微升的 DMSO 试剂盒重建套件中提供的蛋白酶体子。由于基板对光敏感，因此在黑暗或低光条件下执行此步骤。

然后使用20S测定缓冲液，在新的1.5毫升微离心管中产生1至20个蛋白酶体基质的稀释。将所需样品的规范化量添加到 96 井板中。在重复项中运行每个示例。

所需的样品量因组织制备而异。通常，10 到 20 微克对于任何亚细胞分数都足够。用超纯水将样品井体积调至 80 微升。

添加的数量取决于添加的样本量。在两个独立的井中，仅增加80微升水。这些将是检测空白。

在每个井中加入10个20S检测缓冲液，包括检测空白。使用中继器或自动移液器，确保孔的检测量一致。关灯或进入黑暗的房间。

将所有 100 微升稀释的 AMC 标准添加到新井中，每个标准使用一个井。在黑暗中，使用中继器或自动移液器将10微升稀释蛋白酶体基板添加到含有样品和测定空白但不包括AMC标准的井中。将板放入板读卡器中，然后开始动动运行。

使用各种标准西方印迹方案，结合独特的联动特异性多泛素抗体，对从啮齿动物脑组织收集的不同亚细胞分数中的各种多泛素标记进行定量。一些泛素的西方印迹图像将提供不同波段的列，而另一些则生成具有很少或没有清晰线条的污迹图案。为了量化泛素西方印迹，在柱子周围画一个框，延伸整个分子标准阶梯。

如果泛素染色确实延伸到整个梯子，请调整包装盒。这在 Lysine 48 修改中很常见，并且在亚细胞隔间之间差别很大。最后，减去背景，该背景计算为背景在各侧立即围绕列的均光密度。

这里展示的是从同一动物的横向杏仁核收集的不同分数中蛋白酶体活性的定量。在体外蛋白酶体活性测定中，检测到的突触分数、细胞质分数和核分的检测从开始到结束的相对荧光单位增加。蛋白酶体抑制剂β-lac阻止R2在整个会话中变化。

在同一动物的横向杏仁核中观察到蛋白酶体活性的亚细胞差异。在训练有素的动物中检测到核蛋白酶体活性增加，这与突触分数内活动减少相对应。细胞质蛋白酶体活性保持在基线。

这里展示的是同一动物学习后在横向杏仁核中连结特异性蛋白质泛化的亚细胞差异。学习后，核分数的整体泛化率增加，这与细胞质分数的减少有关。学习后，线性泛化增加在核分数，但不是细胞质或突触分数。

有趣的是，K63泛化在学习后在核分数中增加，这与突触分数的减少有关。而K48单体在学习后在核和细胞质分数中增加，但在突触分数中则不增加。该协议还可用于了解同一动物中其他蛋白质的亚细胞分布和功能。