Name: 量化龙脑中的亚细胞泛基蛋白-蛋白酶体活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 了解如何在啮齿动物大脑中量化亚细胞泛素-蛋白酶体活性。本方案通过分离突触、细胞质和细胞核组分，实现同一动物内比较，减少实验动物使用，适用于神经可塑性与疾病机制研究。

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本工作得到了弗吉尼亚理工大学农业与生命科学学院和理学院启动资金的支持。T.M. 受弗吉尼亚理工大学乔治·华盛顿·卡弗项目的资助。

所有涉及动物实验的操作均已获得弗吉尼亚理工学院暨州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 啮齿类动物脑组织的采集与解剖
注意：本方案可适用于多种脑区，并可与不同的组织采集方法联合使用。以下是我们实验室用于分离大鼠脑组织亚细胞组分的操作流程，所用大鼠为8-9周龄雄性Sprague Dawley大鼠。为了在同一动物中处理所有细胞区室，无论采用何种组织采集方法，都必须遵循第1.3节的步骤。
<ol>
	<li>取出大鼠脑组织，放入预先在干冰上预冷的冷冻杯中。在干冰上快速冷冻脑组织，如有条件可使用液氮，并转移至 -80 °C 超低温冰箱中。脑组织可在同一天或之后的时间进行解剖。</li>
	<li>将冷冻的大鼠脑组织从冷冻杯中取出，放入用干冰预冷的大鼠脑切片模具中。模具上的每个槽口对应 0.5 mm 间距，可用于确定目标区域（ROI）的大致位置。
	<ol>
		<li>根据大鼠脑图谱，将剃须刀片插入预测的 ROI 起始位置前方（前侧）的模具槽口中，随后将另一刀片插入预测的 ROI 终止位置（后侧）的槽口中。</li>
		<li>使用解剖刀切除两刀片之间的脑组织切片，并将其置于经干冰预冷的载玻片上。通常切片厚度为 2–3 mm，但具体厚度取决于目标区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用解剖刀逐侧分离目标区域（ROI），将每侧半脑分别放入预先在干冰上预冷的 1.5 mL 微离心管中。冷冻组织可立即用于亚细胞组分分离，或在 -80 °C 保存后于后续时间处理。</li>
</ol>
2. 细胞核与细胞质提取
注意：本实验方案使用常见实验室化学品的预配储备液，包括 0.1 M HEPES、1 M MgCl2、1 M 二硫苏糖醇（DTT）、0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）、5 M NaCl、10% NP-40（IGEPAL）和 50% 甘油。若在蛋白酶体活性检测中使用终点法，可在所有缓冲液中添加甘油和 ATP，以帮助防止裂解过程中蛋白酶体复合物解离。
<ol>
	<li>配制裂解缓冲液。将 8.63 mL 超纯水（去离子并蒸馏）加入一个无菌的 15 mL 圆锥形离心管中。
	<ol>
		<li>向该离心管中加入 1,000 µL 的 0.1 M HEPES、15 µL 的 1 M MgCl、100 µL 的 1 M DTT 和 50 µL 的 10% NP-40。</li>
		<li>加入 100 µL 蛋白酶抑制剂混合物和 100 µL 磷酸酶抑制剂混合物。短暂涡旋混匀后置于湿冰上冷却。注意：溶液可能因磷酸酶抑制剂而呈现淡黄色。 
		注意： 使用蛋白酶抑制剂对于保护蛋白质完整性以及确保体外&#160;蛋白酶体活性测定的特异性至关重要。然而，这些抑制剂也可能轻微降低蛋白酶体活性，因此体外测定所获得的活性值可能略低于实际活性水平。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制提取缓冲液。将 5.925 mL 超纯水（去离子并蒸馏）加入一个无菌的 15 mL 圆锥形离心管中。
	<ol>
		<li>向该离心管中加入 2,000 µL 的 0.1 M HEPES、1,250 µL 的 50% 甘油、15 µL 的 1 M MgCl2、5 µL 的 1 M DTT、5 µL 的 0.5 M EDTA 和 600 µL 的 5 M NaCl。</li>
		<li>加入 100 µL 蛋白酶抑制剂混合物和 100 µL 磷酸酶抑制剂混合物。短暂涡旋混匀后置于湿冰上冷却。注意：溶液可能因磷酸酶抑制剂而呈现淡黄色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出含有 ROI 半脑组织的 1.5 mL 离心管。确保每个实验组内的不同提取条件之间使用对侧半脑进行平衡处理。例如，在两组实验中，每组前两只动物使用左侧半脑，接下来两个样本使用右侧半脑，依此类推。</li>
	<li>使用手术刀将冷冻脑组织转移至 2 mL 玻璃特氟龙匀浆器中。向特氟龙管中加入 500 µL 裂解缓冲液。
	<ol>
		<li>使用 B 型研杵，以 15 次上下研磨匀浆组织，直至无可见固体颗粒残留。每次研磨时采用旋转动作（顺时针或逆时针方向）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器将匀浆后的样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。将管子置于湿冰上，孵育 30 分钟。</li>
	<li>将离心管放入微量离心机中，在 845 × g、4 °C 条件下离心 10 分钟。离心结束后，小心吸取上清液并转移至新的 1.5 mL 微量离心管中；此即细胞质组分，可暂时置于冰上或 4 °C 保存，直至进行第 2.9 节操作。</li>
	<li>向所得沉淀中加入 50 µL 提取缓冲液，并通过移液重悬沉淀。切勿涡旋。将含有重悬沉淀的离心管置于冰上，孵育 30 分钟。</li>
	<li>将离心管放入微量离心机中，在 21,456 × g、4 °C 条件下离心 20 分钟。离心结束后，小心吸取上清液并转移至新的 1.5 mL 微量离心管中；此即核组分。此时沉淀可弃去。</li>
	<li>使用 Dc 蛋白定量试剂盒（按照制造商说明书）或其他适用于非离子型去垢剂提取样品的等效方法，测定细胞质组分和核组分的蛋白浓度。随后立即进行蛋白酶体活性测定（第 4 节）或 Western 印迹分析（第 5 节）。或者，样品可在 -80 °C 保存，待需要时使用。</li>
</ol>
3. 突触组分收集
注意：本实验方案使用常见实验室化学品的预配储备液，包括 1 M Tris（pH 7.5）、0.5 M EDTA、5 M NaCl 和 10% SDS。若在蛋白酶体活性检测中使用终点法，可在所有缓冲液中添加甘油和 ATP，以帮助防止裂解过程中蛋白酶体复合物解离
<ol>
	<li>配制含 320 mM 蔗糖的 TEVP 缓冲液。向一个洁净的 100 mL 烧杯中加入 60 mL 超纯水（去离子并蒸馏）。
	<ol>
		<li>向烧杯中加入 1,300 µL 1 M Tris（pH 7.5）、260 µL 0.5 M EDTA、100 µL 蛋白酶抑制剂混合液、100 µL 磷酸酶抑制剂混合液以及 10.944 g 蔗糖。用磁力搅拌器搅拌，直至蔗糖完全溶解。</li>
		<li>使用移液器逐滴加入盐酸（HCl），将溶液 pH 调至约 7.4。</li>
		<li>将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，用超纯水定容至 100 mL。将最终溶液置于冰上冷藏，待用时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制匀浆缓冲液。向一个洁净的 100 mL 烧杯中加入 60 mL 超纯水（去离子并蒸馏）。
	<ol>
		<li>向烧杯中加入 5,000 µL 1 M Tris（pH 7.5）、3,000 µL 5 M NaCl、100 µL 蛋白酶抑制剂混合液、100 µL 磷酸酶抑制剂混合液以及 2,000 µL 10% SDS。用磁力搅拌器混匀。 
		注意：离子型去垢剂可能因导致蛋白酶体复合物变性而干扰蛋白酶体活性检测。如需保留蛋白酶体功能，可酌情减少 SDS 用量。</li>
		<li>使用移液器逐滴加入 HCl，将溶液 pH 调至约 7.4。</li>
		<li>将溶液转移至 100 mL 容量瓶中，用超纯水定容至 100 mL。将最终溶液在室温下保存；切勿冷藏，以免 SDS 析出沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出含有 ROI 半脑组织的 1.5 mL 离心管。确保每个实验组在不同提取条件下所使用的半脑组织保持对称平衡。例如，在两组实验中，每组前两个动物使用左侧半脑，后两个样本使用右侧半脑，依此类推。</li>
	<li>使用手术刀将冷冻脑组织转移至 2 mL 玻璃特氟龙匀浆器中。向特氟龙管中加入 500 µL TEVP 缓冲液。
	<ol>
		<li>使用 B 型研杵进行 15 次匀浆操作，直至无可见固体物质残留。每次研磨时采用旋转动作（顺时针或逆时针方向）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 1,000 µL 移液器将匀浆后的样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 10 分钟。</li>
	<li>收集上清液，并用 1,000 µL 移液器转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 10 分钟。原始沉淀（P1）含有细胞核和大颗粒碎片，可弃去。</li>
	<li>将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，此为胞质组分。向沉淀（P2）中加入 50 µL 匀浆缓冲液，通过吹打重悬，直至无可见固体物质。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 20,000 x g 离心 10 分钟。将上清液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，此为粗突触体膜（突触）组分。沉淀可弃去。</li>
	<li>使用 Dc 蛋白检测试剂盒（按照制造商说明书）或其他适用于含离子型去垢剂样品的等效方法测定突触组分的蛋白浓度。随后立即进行蛋白酶体活性检测（第 4 节）或 Western blot 分析（第 5 节）。或者，样品可在 -80 °C 保存，待用时取出。</li>
</ol>
4. 蛋白酶体活性检测
注意：可使用稍作修改的 20S 蛋白酶体活性检测试剂盒，在匀浆化脑组织中检测蛋白酶体活性。该检测方法不直接测量完整 26S 蛋白酶体复合物的活性，而是测量 20S 核心的活性，因此仅能作为了解核心本身活性的替代指标，而非整个 26S 蛋白酶体复合物的活性。该检测的成功率会随着反复冻融循环和/或去垢剂（尤其是离子型去垢剂）浓度的增加而下降，且需要使用配备 360/460（激发/发射）滤光片并具备最高达 37 °C 加热功能的酶标仪。
<ol>
	<li>酶标仪设置：预热至 37 °C，并在整个运行过程中保持该温度。
	<ol>
		<li>将激发波长设为 360 nm，发射波长设为 460 nm。如果使用的 96 孔板为透明板，则将光学检测位置设为底部；如果使用深色/黑色 96 孔板，则将光学检测位置设为顶部。</li>
		<li>对于较老型号的酶标仪，在荧光读数选项中设置为自动增益；新型号仪器已预设为此模式。设定动力学程序运行 2 小时，每 30 分钟扫描（读取）一次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 13.5 mL 超纯水重悬试剂盒中提供的 10x 检测缓冲液。向已稀释为 1x 的缓冲液中加入 14 µL 的 100 mM ATP；这能显著增强样品中的蛋白酶体活性，并提高检测的可靠性。最终的 20S 检测缓冲液可在使用前置于冰上或 4 °C 保存，数月内保持稳定。</li>
	<li>使用 100 µL DMSO 重悬试剂盒中提供的 AMC 标准品。此步骤应在避光或低光照条件下进行，因为该标准品对光敏感。</li>
	<li>使用重悬后的标准品在避光或低光照条件下建立 AMC 标准曲线。
	<ol>
		<li>在不同的 0.5 mL 微离心管中，分别加入 16、8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4 和 0 µL 的 AMC 标准品，对应 AMC 浓度分别为 20、10、8、4、2、1、0.5 和 0 µM。</li>
		<li>按相同顺序，向上述各管中分别加入 84、92、93.6、96.8、98.4、99.2、99.6 和 100 µL 的 20S 检测缓冲液。由此建立一系列从高到低的 AMC 浓度，用于酶标仪校准及对匀浆样品中蛋白酶体活性的分析。</li>
		<li>将所有稀释后的标准品在避光条件下置于冰上保存，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 65 µL DMSO 重悬试剂盒中提供的蛋白酶体底物（Suc-LLVY-AMC）。此步骤应在避光或低光照条件下进行，因为该底物对光敏感。在新的 1.5 mL 微离心管中，使用 20S 检测缓冲液将蛋白酶体底物按 1:20 比例稀释。稀释后的底物在避光条件下置于冰上保存，直至使用。 
	注意：例如，若待测板包含 10 个样品和 1 个空白，则需要足够用于 22 个孔（设复孔）的稀释底物，每孔 10 µL。即共需 220 µL，另加 30 µL 以补偿移液误差，因此需要 12.5 µL 底物和 237.5 µL 的 20S 检测缓冲液。</li>
	<li>将所需样品（如为冷冻状态）解冻，并加入定量均一的样品至 96 孔板中。每个样品设复孔。所需样品量取决于组织制备方式。通常，任一亚细胞组分中 10–20 µg 蛋白即已足够。</li>
	<li>用超纯水将各孔样品体积补足至 80 µL。所加水量取决于已加入的样品体积。例如，若样品 1 加入了 4.5 µL 蛋白，样品 2 加入了 8.7 µL，则所需加水量分别为 75.5 µL 和 71.3 µL。另取两个独立孔，各加入 80 µL 水，作为空白对照孔（Assay Blanks）。 
	注意：为减少因移液误差导致的蛋白体积变化，可将蛋白浓度归一化至最低浓度样品，从而在所有条件下使用相同的样品体积。</li>
	<li>向每个孔（包括空白对照孔）加入 10 µL 的 20S 检测缓冲液。建议使用多通道/自动移液器，以确保各孔检测体积一致。</li>
	<li>可选步骤：在此阶段，如需进行体外&#160;干预操作，则每个样品需额外增加 2 个孔用于每种处理（包括溶剂对照）。若进行此操作，向其中两个样品孔加入 5–10 µL 目标药物/化合物，向另两个孔加入等体积的对照/溶剂。将 96 孔板置于预热的酶标仪或 37 °C 培养箱中孵育 30 分钟。</li>
	<li>关闭灯光或进入暗室。将全部 100 µL 稀释后的 AMC 标准品加入新孔中；每种标准品使用一个独立孔。</li>
	<li>在暗处，向含样品和空白对照的孔中各加入 10 µL 稀释后的蛋白酶体底物，但不要加入 AMC 标准品孔中。建议使用多通道/自动移液器，以确保各孔检测体积一致。</li>
	<li>将 96 孔板放入酶标仪，启动动力学程序运行。 
	注意：动力学运行期间无需持续震荡，但用户可根据需要选择开启。</li>
	<li>动力学运行结束后，将原始的 360/460 荧光值导出至 Microsoft Excel。
	<ol>
		<li>对每个标准品、每个样品及空白对照的 5 次扫描数据中的复孔进行平均。样品的原始荧光值应随扫描次数增加而上升，而标准品和空白对照的荧光值应保持稳定或略有下降。</li>
		<li>取最高浓度 AMC 标准品孔的平均值，除以其已知浓度（20 µM），再将该结果除以检测中所用的样品浓度，得到标准化的 AMC 值。对每个样品和空白对照的平均值，均除以该标准化 AMC 值。</li>
		<li>将所得数值再除以检测中所用的样品浓度，得到各样品及空白对照的归一化值。对全部 5 次扫描均执行此计算。</li>
		<li>用每次扫描中各样品的归一化值减去空白对照的归一化值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 特定连接方式的蛋白质泛素化定量
<ol>
	<li>应使用多种标准的蛋白质印迹（Western blotting）方案，结合特异性的连接位点识别多聚泛素抗体，对从啮齿类动物脑组织中分离的不同亚细胞组分中的多种多聚泛素标记进行定量分析。
	<ol>
		<li>进行变性处理时，按照制造商说明，将已归一化的样品与等体积的Laemmli上样缓冲液混合，并加入β-巯基乙醇至终体积浓度为5%。</li>
		<li>若需定量所有类型的单泛素化及不依赖连接方式的多聚泛素化修饰，请使用广谱泛素抗体（pan-ubiquitin antibody）。</li>
		<li>为识别所有多聚泛素化蛋白，应选用不与单泛素化发生交叉反应的泛素抗体。</li>
		<li>针对特异性连接方式的多聚泛素化修饰，应使用可分别识别Lysine-27、Lysine-48、Lysine-63以及线性（M1）连接型多聚泛素化的特异性抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为防止不同抗体显影之间的交叉污染（可能导致假阳性结果或干扰其他泛素修饰的成像），每次显影后应使用0.1 M NaOH处理膜10分钟以剥离抗体。
	<ol>
		<li>用含0.1% Tween的TBS缓冲液洗涤膜两次，每次10分钟，随后重新封闭（采用所用Western blot方案中偏好的封闭剂）。</li>
		<li>将膜与二抗孵育并再次显影，以确认膜上的初抗和二抗已被彻底去除。</li>
		<li>推荐：为实现不同泛素抗体的成功显影且避免交叉污染，建议使用荧光或近红外成像系统，此类系统通常可有效防止抗体间的信号残留。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>某些泛素蛋白印迹图像会呈现清晰条带组成的独立泳道（如M1连接型），而其他类型则表现为弥散状信号，条带模糊或无明显分离（K48连接型常见）。在对成像后的泛素蛋白印迹进行定量时，应在目标泳道周围绘制一个覆盖整个分子量标准蛋白梯度范围的矩形区域。
	<ol>
		<li>若泛素染色信号未贯穿整个分子量梯度，可相应向上或向下调整矩形区域的位置；此情况在Lysine-48修饰中较为常见，且在不同亚细胞区室间存在显著差异。</li>
		<li>扣除背景信号，背景值取自该泳道四周紧邻区域的平均光密度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jarome, T. J., Werner, C. T., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependent+protein+degradation+is+critical+for+the+formation+and+stability+of+fear+memory+in+the+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activity dependent protein degradation is critical for the formation and stability of fear memory in the amygdala.</a> PLoS One. 6 (9), e24349(2011).</li>
<li>Lopez-Salon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+cascade+is+required+for+mammalian+long-term+memory+formation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome cascade is required for mammalian long-term memory formation.</a> European Journal of Neuroscience. 14 (11), 1820-1826 (2001).</li>
<li>Reis, D. S., Jarome, T. J., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+formation+for+trace+fear+conditioning+requires+ubiquitin-proteasome+mediated+protein+degradation+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Behavior+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Memory formation for trace fear conditioning requires ubiquitin-proteasome mediated protein degradation in the prefrontal cortex.</a> Frontiers in Behavior Neuroscience. 7, 150(2013).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mAChR-dependent+decrease+in+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+novel+taste+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">mAChR-dependent decrease in proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for novel taste learning.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 135, 115-124 (2016).</li>
<li>Rosenberg, T., Elkobi, A., Dieterich, D. C., Rosenblum, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-dependent+proteasome+activity+in+the+gustatory+cortex+is+necessary+for+conditioned+taste+aversion%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">NMDAR-dependent proteasome activity in the gustatory cortex is necessary for conditioned taste aversion.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 130, 7-16 (2016).</li>
<li>Orsi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+subcellular+changes+in+proteasome+activity+and+linkage-specific+protein+polyubiquitination+in+the+amygdala+during+the+consolidation+and+reconsolidation+of+a+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Distinct subcellular changes in proteasome activity and linkage-specific protein polyubiquitination in the amygdala during the consolidation and reconsolidation of a fear memory.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 157, 1-11 (2019).</li>
<li>Cullen, P. K., Ferrara, N. C., Pullins, S. E., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context+memory+formation+requires+activity-dependent+protein+degradation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Context memory formation requires activity-dependent protein degradation in the hippocampus.</a> Learning and Memory. 24 (11), 589-596 (2017).</li>
<li>Jarome, T. J., Ferrara, N. C., Kwapis, J. L., Helmstetter, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaMKII+regulates+proteasome+phosphorylation+and+activity+and+promotes+memory+destabilization+following+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">CaMKII regulates proteasome phosphorylation and activity and promotes memory destabilization following retrieval.</a> Neurobiology of Learning and Memory. 128, 103-109 (2016).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+protein+degradation+underlies+destabilization+of+retrieved+fear+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory.</a> Science. 319 (5867), 1253-1256 (2008).</li>
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<li>Kelly, P. T., Cotman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+proteins.+Characterization+of+tubulin+and+actin+and+identification+of+a+distinct+postsynaptic+density+polypeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic proteins. Characterization of tubulin and actin and identification of a distinct postsynaptic density polypeptide.</a> Journal of Cell Biology. 79 (1), 173-183 (1978).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在此，我们展示了一种在同一动物不同亚细胞区室中定量泛素-蛋白酶体活性变化的高效方法。目前，大多数测量泛素-蛋白酶体系统在亚细胞水平活性变化的尝试均局限于每份样本仅检测一个区室，因而需要重复实验，导致显著的成本增加和动物资源的浪费。我们的实验方案通过分割脑半球，使同一动物的两个半球可分别用于获取不同的细胞组分，从而解决了这一问题。利用该方案，我们首次证明了在同一动物中，学习过程可诱导泛素-蛋白酶体活性在细胞核、细胞质和突触组分中发生差异性变化21。
本方案的主要局限性在于其依赖于所获取的脑组织（样本）量。例如，如上所述，本方案要求将特定脑区的两个半球分开处理。然而，这并不总是可行的，例如某些仅存在于一侧半球的脑区。在此类情况下，可首先将整个脑区使用突触组分分离步骤（第3.1节）中的TEVP缓冲液进行匀浆处理，因为该缓冲液不含任何变性剂。随后，可按体积将样品均分为两部分。第一部分可按照所述方案用于突触组分的提取；对于第二部分样品，可加入非离子型去污剂NP-40至终浓度为0.05%，然后按照第2.6节所述进行离心。这将使胞质蛋白分布于上清液...

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是一个由相互关联的蛋白质结构和连接酶组成的复杂网络，负责调控细胞内大多数短寿命蛋白质的降解1。在该系统中，蛋白质通过小分子修饰物泛素被标记，以决定其降解或其他细胞过程和命运。一个靶蛋白可获得1至7个泛素修饰，这些修饰可在前一个泛素分子的七个赖氨酸（K）位点（K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63）或N端甲硫氨酸（M1；也称为线性）处连接成链2。其中某些多聚泛素标签特异性地介导蛋白质降解（如K48）3，而另一些则主要不依赖于蛋白质降解过程（如M1）4,5,6。因此，蛋白质泛素化过程极为复杂，能够定量检测特定多聚泛素标签的变化对于最终理解该修饰在细胞功能中的作用至关重要。此外，由于蛋白酶体作为UPS的催化结构7，不仅参与蛋白质降解，还可参与其他非蛋白水解过程8,9，这进一步增加了研究该系统的复杂性。因此，自该系统被发现以来，正常的和异常的泛素-蛋白酶体活性已被证实与长期记忆形成以及多种疾病状态相关，包括许多神经系统、神经退行性和精神类疾病10,11。因此，能够有效且高效地定量检测脑内UPS活性的方法，对于深入理解该系统在疾病状态下如何失调，以及最终开发靶向泛素和/或蛋白酶体功能的治疗策略至关重要。
在利用大鼠和小鼠脑组织定量泛素-蛋白酶体活性时存在若干问题，而大鼠和小鼠是研究泛素-蛋白酶体系统（UPS）功能最常用的模型系统，这些问题包括：1）泛素修饰的多样性，以及 2）UPS 功能在不同亚细胞区室中的分布及其差异性调控12,13,14。例如，早期许多关于记忆形成过程中脑内泛素-蛋白酶体功能的研究使用了全细胞裂解液，结果显示蛋白质泛素化水平和蛋白酶体活性均呈现时间依赖性升高15,16,17,18,19,20。然而，我们最近发现，在学习过程中，泛素-蛋白酶体活性在不同亚细胞区室之间表现出显著差异，某些区域同时出现活性升高而其他区域则下降，这种模式与先前在全细胞裂解液中报道的结果存在明显不同21。这反映出全细胞分析方法的局限性，因其无法区分不同亚细胞区室中UPS活性变化的各自贡献。尽管近期一些研究已采用突触组分分离方法，专门研究学习过程中突触部位的UPS功能22,23,24，但这些方法无法在同一动物个体中同时检测细胞核和细胞质内的泛素-蛋白酶体变化。这导致必须多次重复实验，每次收集不同的亚细胞组分。这不仅造成实验动物不必要的损耗，而且排除了在特定事件或特定疾病状态下直接比较不同亚细胞区室间UPS活性的可能性。鉴于泛素和蛋白酶体的蛋白质靶标在整个细胞中具有高度异质性，明确泛素-蛋白酶体信号在不同亚细胞区室中的差异，对于揭示UPS在记忆形成以及神经、神经退行性和精神疾病过程中所发挥的功能作用至关重要。
为满足这一需求，我们近期开发了一种方法，可从同一只动物的特定脑区同时获取细胞核、细胞质和突触组分21此外，为了应对从同一样本中收集多个亚细胞组分所能获得的蛋白质数量有限的问题，我们对先前建立的方案进行了优化，以用于体外检测&#160;裂解的啮齿类动物脑组织细胞中蛋白酶体活性及特异性泛素化蛋白的连接状态。利用本方案，我们能够收集并直接比较大鼠侧杏仁核中细胞核、细胞质及突触部位依赖学习过程的蛋白酶体活性变化，以及K48、K63、M1和总体蛋白质多聚泛素化水平的变化。本文详细描述了我们的实验流程 (图1），这有望显著增进我们对泛素-蛋白酶体系统（UPS）在长期记忆形成及多种疾病状态中作用的理解。然而需要注意的是，本方案中讨论的体外蛋白酶体活性检测方法尽管被广泛使用，但并不能直接反映完整26S蛋白酶体复合物的活性。该检测方法实际测量的是20S核心颗粒的活性，因此仅能作为评估20S核心颗粒自身活性的间接指标，而不能代表整个26S蛋白酶体复合物的活性。

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>15575020</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>20S 蛋白酶体活性检测试剂盒</td><td>Millipore Sigma</td><td>APT280</td><td>其他供应商提供不同版本</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher</td><td>FERR1441</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>β-肌动蛋白抗体</td><td>Cell signaling</td><td>4967S</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>β-微管蛋白抗体</td><td>Cell signaling</td><td>2128T</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>BioTek Synergy H1 酶标仪</td><td>BioTek</td><td>VATECHH1MT3</td><td>其他供应商提供不同版本</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Fisher</td><td>ICN19024280</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>Clasto 乳胞素 β-内酯</td><td>Millipore Sigma</td><td>L7035</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>冷冻杯</td><td>Fisher</td><td>033377B</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>DMSO</td><td>D8418</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Millipore Sigma</td><td>D0632</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Millipore Sigma</td><td>G5516</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>H3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>H3375</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher</td><td>SA48</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Millipore Sigma</td><td>I3021</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>K48 泛素抗体</td><td>Abcam</td><td>ab140601</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>K63 泛素抗体</td><td>Abcam</td><td>ab179434</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9541</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>KONTES 组织研磨器</td><td>VWR</td><td>KT885300-0002</td><td>其他多个制造商/型号</td></tr><tr><td>Laemmli 样品缓冲液</td><td>Bio-rad</td><td>161-0737</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>线性泛素抗体</td><td>Life Sensors</td><td>AB-0130-0100</td><td>仅 M1 抗体</td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>442611</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>2231000213</td><td>其他多个制造商/型号</td></tr><tr><td>myr-AIP</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-P212-0500</td><td>Millipore-Sigma 有售</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S3014</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>Odyssey Fc 成像系统</td><td>LiCor</td><td>2800-02</td><td>其他供应商提供不同版本</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>524625</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 标准品</td><td>Bio-rad</td><td>161-0373</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>P8340</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>PSD95 抗体</td><td>Cell signaling</td><td>3450T</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3771</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher</td><td>SS255</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore Sigma</td><td>S0389</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>TBS</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62938</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-100</td><td>其他多个供应商</td></tr><tr><td>泛素抗体</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-PW8810</td><td>其他多个供应商</td></tr></tbody></table>

量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

Quantifying Subcellular Ubiquitin-proteasome Activity in the Rodent Brain

泛素-蛋白酶体系统是真核生物中蛋白质降解及多种其他细胞过程的关键调控机制。在脑组织中，泛素-蛋白酶体活性的增强对于突触可塑性和记忆形成至关重要，而该系统的异常改变则与多种神经系统、神经退行性及精神类疾病相关。研究脑内泛素-蛋白酶体功能的一个难题在于，该系统存在于所有细胞区室中，而其蛋白质靶标、功能角色及调控机制在不同区室间可能存在显著差异。因此，能够在同一只动物体内直接比较不同亚细胞区室中泛素蛋白靶向修饰和蛋白酶体催化活性的能力，对于全面理解泛素-蛋白酶体系统（UPS）在突触可塑性、记忆及疾病中的作用至关重要。本文所述方法可从同一只啮齿类动物（大鼠）脑组织中分离出细胞核、细胞质及粗突触组分，并进而同时定量检测蛋白酶体的催化活性（间接测定，仅反映蛋白酶体核心的活性）以及连接类型特异性的泛素蛋白标记。因此，该方法可用于在同一只动物中直接比较不同脑区在突触可塑性、记忆形成及不同疾病状态下泛素-蛋白酶体活性的亚细胞变化。该方法还可用于评估其他蛋白质在同一只动物体内的亚细胞分布与功能。

采用本文所述方法，从大鼠脑的侧杏仁核中分离出细胞核、细胞质和突触组分（图1）。通过蛋白质印迹法检测各组分的纯度，使用针对应富集或耗竭于裂解液中蛋白质的抗体进行探查。在第一个半脑中收集了粗制突触组分，结果显示突触后密度蛋白95（PSD95）存在于突触组分中，而不存在于细胞核组分中，细胞质中的含量较低（图2A）。这与先前研究结果一致，表明突触组分的制备方法可同时分离出突触前和突触后成分25。相反，细胞核蛋白组蛋白H3存在于细胞核组分中，但不存在于突触组分中，细胞质中的含量也较低（图2B）。PSD95和H3在细胞质中的存在与其在细胞质中的翻译过程一致。细胞质蛋白β-微管蛋白存在于我们的细胞质组分中，但在细胞核裂解液中基本检测不到（图2C），在突触区域的含量也较低。这表明我们成功获得了基本不含细胞...

本方案旨在高效定量啮齿类动物脑组织不同细胞区室中泛素-蛋白酶体系统（UPS）的活性。使用者可在同一只动物中检测核、胞质和突触组分内的UPS功能，从而减少进行此类复杂分析所需的时间和动物数量。

泛素-蛋白酶体系统是真核生物中蛋白质降解及多种其他细胞过程的关键调控机制。在脑组织中，其活性的增强……

该方案可检测啮齿类动物脑组织中亚细胞水平的蛋白质泛素化程度及蛋白酶体活性，从而在同一个体内部比较泛素-蛋白酶体系统活性在细胞活动、学习或疾病状态下的变化情况。本方案允许从同一只啮齿类动物脑组织中分离突触、胞质和核组分。该方法损失小，适用于少量组织样本，并可使用常规实验室设备完成。本实验操作将由我实验室的研究生 Taylor McFadden 演示。请按照文本方案中所述，首先进行啮齿类动物脑组织的采集与解剖。确保每个实验组的不同提取条件下，所使用的脑半球是交叉平衡的。从–80摄氏度冰箱中取出含有目标区域半脑的1.5毫升离心微量管。使用解剖刀将冷冻脑组织转移至2毫升玻璃特氟龙匀浆器中。向特氟龙管中加入500微升裂解缓冲液。使用研杵B，以15次研磨充分匀浆组织，直至肉眼不可见任何固体物质。每次研磨时应采用旋转动作。用1,000微升移液器将匀浆后的样品转移至新的1.5毫升微量离心管中。将离心管置于湿冰上，孵育30分钟。将离心管放入微量离心机中，在4°C条件下以845 ×g离心10分钟。离心结束后，小心用移液器吸除上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。这是细胞质组分。向所得沉淀中加入50 µL提取缓冲液，用移液器吹打重悬。切勿涡旋沉淀。将含有重悬沉淀的离心管置于冰上，孵育30分钟。然后在4°C条件下，以21,456 ×g离心20分钟。离心结束后，小心用移液器吸除上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。这是核组分。将目标区域的半侧脑组织按前述方法匀浆，但使用500微升TEVP缓冲液代替裂解缓冲液。使用1,000微升移液器，将匀浆后的样品转移至新的1.5毫升微量离心管中。在4 °C条件下，以1,000 × g离心样品10分钟。使用1,000 µL移液器收集上清液，并转移至新的1.5 mL微量离心管中。在4 °C条件下，以10,000 × g再次离心样品10分钟。弃去含有细胞核和大颗粒碎片的原始沉淀物。将上清液转移至新的1.5毫升微量离心管中。此为胞质组分。向沉淀中加入50 µL裂解缓冲液，通过移液吹打重悬，直至无可见固体物质。在4 °C条件下，以20,000 ×g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。这是粗制突触体膜组分。进行检测前，将酶标仪预热至37摄氏度，并在整个运行过程中保持该温度。设置激发波长为360纳米，发射波长为460纳米。如果使用的96孔板为透明板，将光学检测位置设为底部；如果使用黑色96孔板，则将光学检测位置设为顶部。设置动力学检测程序，总时长为两小时，每30分钟扫描一次。使用 13.5 毫升超纯水重悬试剂盒中提供的 20S 10X 检测缓冲液。向现已稀释为 1X 的缓冲液中加入 14 微升 100 毫摩尔 ATP。这将显著增强样品中蛋白酶体的活性，并提高检测的可靠性。使用100微升DMSO溶解试剂盒中提供的AMC标准品。由于该标准品对光敏感，操作AMC标准品时应在避光或低光照条件下进行。通过一系列从高到低的AMC浓度建立AMC的标准曲线。该曲线将用于酶标仪的校准以及对匀浆样品中蛋白酶体活性的分析。用65 µL DMSO溶解试剂盒中提供的蛋白酶体底物。同时，此步骤需在避光或低光照条件下进行，因为底物对光敏感。然后在新的 1.5 毫升微量离心管中，使用 20S 检测缓冲液将蛋白酶体底物稀释至 1:20。将等量的待测样品加入 96 孔板中。每个样品设置两个复孔。所需样品的量取决于组织制备方式。通常，任何亚细胞组分有10至20微克即足够。用超纯水将样品体积补足至80微升。加入的量取决于所加样本的体积。在两个独立的孔中，各加入80微升水。这些孔将作为检测空白对照。向每个孔中加入10 µL 20S检测缓冲液，包括检测空白孔。使用排枪或自动移液器以确保各孔间的检测体积一致。关闭灯光或进入暗室。使用单个孔分别加入稀释后的AMC标准品，将全部100微升加入新孔中。在避光条件下，使用多通道移液器或自动移液器向含有样品和检测空白的孔中加入10微升稀释的蛋白酶体底物，但不加入AMC标准品。将酶标板放入酶标仪中，并启动动力学检测程序。使用多种标准的蛋白质印迹（Western blotting）方法，结合特异识别不同连接方式的多聚泛素抗体，对从啮齿类动物脑组织中分离的不同亚细胞组分中的多种多聚泛素标记进行定量分析。某些泛素蛋白印迹图像会呈现由清晰条带组成的列状信号，而另一些则呈现弥散的涂布样模式，仅有少数或无明显条带。在对成像后的泛素蛋白印迹进行定量时，应围绕目标条带列绘制一个矩形框，该框需覆盖整个分子量标准蛋白梯度的范围。如果泛素染色确实贯穿整个蛋白条带，则调整该区域。这种情况在赖氨酸48修饰中较为常见，且在不同亚细胞结构中差异显著。最后，扣除背景值，背景值计算为泳道四周紧邻区域的平均光密度。图中显示了从同一只动物的侧杏仁核不同组分中检测到的蛋白酶体活性定量结果。在体外蛋白酶体活性检测过程中，突触组分、胞质组分和核组分中的相对荧光单位（RFU）在检测期间均随时间逐渐增加。蛋白酶体抑制剂 beta-lac 阻止了各组分中 RFU 在检测过程中的变化。在同一动物的侧杏仁核中观察到蛋白酶体活性存在亚细胞水平的差异。与对照组相比，训练组动物细胞核内的蛋白酶体活性升高，而突触组分中的活性则相应降低。细胞质中的蛋白酶体活性保持在基线水平。图中显示了同一动物在学习后，其侧杏仁核中不同亚细胞区域蛋白质泛素化修饰位点特异性的差异。学习后，细胞核组分中的总体泛素化水平升高，而胞质组分中的泛素化水平则相应降低。学习后，细胞核组分中的线性泛素化有所增加，但在胞质组分或突触组分中未见增加。有趣的是，学习后细胞核组分中的K63泛素化水平升高，而突触组分中的K63泛素化水平则相应降低。而K48泛素化在学习后于细胞核和细胞质组分中均升高，但在突触组分中未见升高。该方案也可用于研究同一动物体内其他蛋白质的亚细胞分布及其功能。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

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本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。...

使用自动图像分析法对啮齿类动物模型黑质中多巴胺能神经元密度进行半定量测定

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。...

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

本方案介绍了如何通过重组蛋白纯化与泛素链切割实验相结合，来检测与神经发育障碍相关的遗传变异对去泛素化酶活性的影响。...

通过体外泛素链切割实验测定与神经发育障碍相关的去泛素化酶的酶活性

了解如何在啮齿动物大脑中量化亚细胞泛素-蛋白酶体活性。本方案通过分离突触、细胞质和细胞核组分，实现同一动物内比较，减少实验动物使用，适用于神经可塑性与疾病机制研究。

量化啮齿类动物大脑中亚细胞水平的泛素-蛋白酶体活性

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