高通量，复用和有针对性的蛋白质组学分析脑脊液量化神经退行性生物标志物和载脂蛋白E亚型状态

我们描述了一种高通量，多重，和有针对性的蛋白质组学脑脊液（CSF）试验与临床翻译潜在发展。该试验可定量潜在标记和危险因素的神经变性，如载脂蛋白E的变体（E2，E3和E4），并测量它们的等位基因的表达。

该方法的总体目标是快速、经济地定量脑脊液或 CSF 中的多种生物标志物，以评估它们在诊断和治疗监测中的用途。这是一种新的检测方法，使我们能够测量以前无法测量的生物标志物。我们认为这可用于诊断目的，也可用于区分不同的神经退行性疾病，并可能提供预后信息。

该技术的主要优点是其设计快速、样品制备简单、特异性高且经济高效，可转化为临床实验室。这项技术的影响延伸到治疗或诊断，因为这种高通量测试可用于神经退行性变新疗法的未来临床试验。该方法也适用于其他疾病和组织，例如尿液治疗肾脏疾病，血浆治疗心肌病，细胞治疗多能性。

要开始此程序，请根据制造商的说明将所需的合成肽重悬至每毫升 1 毫克的储备浓度。从储备液浓度中制备 1/10 稀释的肽，并将每种肽的 1， 000 皮摩尔汇集到低结合微量离心管中。在 SpeedVac 浓缩器中干燥混合肽样品。

完成后，将样品储存在零下 20 摄氏度。接下来，将 100 μL CSF 分装到低结合微量离心管中。冷冻干燥 CSF 样品。

在消化缓冲液中重悬混合肽样品的等分试样，以获得每微升 10 和 1 皮摩尔的浓度。现在，将混合的肽样品加标到冻干的 100 微升 CSF 等分试样中，浓度为 0、1、2、5、10 和 15 皮摩尔。然后，加入 20 ng 完整无关蛋白作为内标，并控制胰蛋白酶的消化效率。

将消化缓冲液添加到 CSF 等分试样中，最终体积为 20 μL，然后涡旋样品。然后，根据标准方案加入 1.5 μL 二硫苏糖醇消化样品，并在室温下振荡 1 小时。然后，向样品中加入 3 μL 碘乙酰胺，并在室温下避光摇动 45 分钟。

然后，加入 165 微升双蒸水。向样品中加入 10 μL 0.1 μg/μL 的测序级改良胰蛋白酶溶液，重悬于 50 毫摩尔碳酸氢铵缓冲液中。将样品在 37 摄氏度的水浴中孵育过夜。

然后，通过冷冻样品来停止消化。在冰上解冻 CSF 消化物后，以 16， 000 倍 g 离心 10 分钟。完成后，将 60 微升每种消化物转移到 300 微升玻璃插入物中。

使用配备 C18 UPLC 色谱柱的 LC-MS 系统，以 10 分钟的 1 至 40% 乙腈线性梯度从标准曲线点进样最高浓度。运行完成后，在软件中打开生成的色谱图，并记下保留时间和每种肽的前两个最强的通道。根据此信息，使用定时通道更新之前创建的多反应监测或 MRM 方法，以测量肽。

为了保持灵敏度，对于每个肽段，请保持每个通道的每个峰点大于 8 且驻留时间大于 0.01 秒，至少有一个通道。通过在 MS 方法文件中选择方法事件中的溶剂延迟，在 MRM 方法中包括溶剂延迟。在短 HPLC 方法中正确匹配正确的峰至关重要。

这可以通过在基质中用于标准曲线的加标肽段来完成，并在方法开发过程中观察多个通道。最后，手动查看数据注释以确保准确性。分析每种肽，并与适当的稳定同位素标记的内标进行比值。

此处显示了来自高通量 CSF 测定的重要肽标志物的色谱图。该数据给出了相关稳定同位素标记内标的标准化比率，可用于确定 CSF 绝对浓度，并针对临床样本的变化进行统计分析。对该CSF测定中包含的74种肽的定量显示，25种肽在痴呆患者的CSF中发生显著改变，痴呆标志物前食欲素和YKL几丁质酶-3样蛋白的结果显示在此处。

ApoE4 是阿尔茨海默病的已知危险因素，ApoE 亚型的检测基于对亚型 E2 和 E4 氨基酸变化的相应肽的检测。此处显示了每种亚型组合的预期峰模式。一旦方法建立好，如果执行得当，可以在一天内完成检测。在这种方法开发之后，可以测量一组具有高分析灵敏度和特异性的新生物标志物，这将使研究人员能够以新的方式评估神经退行性疾病。

观看此视频后，您应该对如何设计和优化 MRM 分析的灵敏度和特异性有很好的了解。不要忘记，与 DTE、白蚁、甲酸和人体组织一起工作可能非常危险，在此过程中应采取预防措施，例如戴手套。