Name: 高通量，复用和有针对性的蛋白质组学分析脑脊液量化神经退行性生物标志物和载脂蛋白E亚型状态 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 了解高通量多重靶向蛋白质组学分析方法，用于脑脊液中神经退行性生物标志物和载脂蛋白E亚型的定量检测。该技术具有快速、简便、高特异性和成本效益的优势，可应用于神经退行性疾病的诊断、治疗监测及临床试验。

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本研究工作由英国大奥蒙德街医院国家健康研究所生物医学研究中心的GOSomics研究计划资助并推动，同时得到伦敦大学学院儿童健康研究所UCL生物质谱中心以及Szeban Peto基金会慷慨捐赠的支持。痴呆研究中心是阿尔茨海默病研究英国中心（Alzheimer's Research UK）的协调中心。作者感谢阿尔茨海默病研究英国中心（Alzheimer's Research UK）、NIHR皇后广场痴呆生物医学研究中心、UCL/H生物医学研究中心以及伦纳德·沃尔夫森实验神经学中心提供的支持。

注意：本文所述整体方案的示意图见图1。本方法开发所用的所有样本均为临床诊断剩余样本，并已获得伦敦布鲁姆斯伯里伦理委员会的伦理批准。
<img alt="蛋白质组学工作流程图；脑脊液中阿尔茨海默病标志物的LC-MRM分析；胰蛋白酶消化。" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 创建靶向脑脊液MRM LC-MS/MS检测方法整体流程的示意图。 从蛋白质靶标中选择用于评估的候选标志肽。利用定制合成的肽段，建立靶向LC-MS/MS多重检测方法。经过评估后，该检测方法可用于评估神经退行性疾病潜在标志物的有效性。
1. 肽段的选择与设计
注意：标志物肽段的标准是必须具有唯一性（proteotypic），并能代表该蛋白质的定量丰度（quantotypic）。要确定某肽段是否具有唯一性，可使用 UniProt 网站（http://www.uniprot.org/blast/）上的“blast”搜索工具。
<ol>
	<li>定义一组目标蛋白（标记物）， 即，ApoE（参见 表2). 
	注意：如果该标志物是基于先前的蛋白质组学分析实验确定的8，然后从该数据集中选择产生最佳响应的肽段。</li>
	<li>如果此信息不可用，请使用开源网站，例如 in silico 使用 MS-Digest 等软件工具对目标蛋白进行胰蛋白酶消化。</li>
	<li>选择为胰蛋白酶肽且不易发生翻译后修饰的肽段。 
	注意：此信息可在 UniProt 网站 www.uniprot.org 上查询。避免使用在液相色谱-质谱（LC-MS）样品制备过程中易发生化学修饰的肽段。</li>
	<li>订购所选肽段的定制合成。 
	注意：标记肽可由多家商业公司定制合成。用于检测总ApoE水平的定量肽段为AATVGSLAGQPLQER。用于确定E2和E4亚型的特征肽段分别为第158位点的胰蛋白酶切肽段（RLAVYQAGAR和CLAVYQAGAR）以及第112位点的胰蛋白酶切肽段（LGADMEDVCGR和LGADMEDVR）。</li>
</ol>
2. 标准肽的制备
注意：为了选择最佳的定量转化，需要优化基质（脑脊液）的检测。优化多重肽段的最有效方法是将已知浓度的肽段制成混合物。这些混合物可用于方法开发和标准曲线的建立。
<ol>
	<li>根据制造商说明书，将合成多肽（多肽详细信息见表2）重悬至1 mg/ml的储备浓度。若无说明书，默认使用50:50（v/v）乙腈（ACN）/H2O溶解多肽。</li>
	<li>将多肽储备液进行1:10稀释，并将每种多肽各1,000 pmol加入低吸附微量离心管中。使用真空浓缩仪将最终混合液干燥，于-20 °C保存。可制备多份混合物以供后续使用。</li>
	<li>将100 µl脑脊液（CSF）分装至低吸附管中。进行冷冻干燥。</li>
	<li>将1,000 pmol混合多肽的等分试样用消化缓冲液（100 mM Tris HCl，pH 7.8，6 M 尿素，2 M 硫脲，2% ASB14）重悬，得到10 和 1 pmol/µl的浓度。</li>
	<li>将混合多肽以0、1、2、5、10 和 15 pM的浓度加入至100 µl冻干的脑脊液等分试样中。加入20 ng完整且无关的蛋白质（如酵母烯醇化酶），作为内标并用于监测胰蛋白酶消化效率。</li>
	<li>用消化缓冲液将脑脊液等分试样补至终体积20 µl。涡旋混匀。</li>
	<li>加入1.5 µl二硫苏糖醇（DTT）溶液（30 mg溶于1 ml 100 mM Tris HCl，pH 7.8），室温振荡反应1小时。</li>
	<li>加入3 µl碘乙酰胺溶液（35 mg溶于1 ml 100 mM Tris HCl，pH 7.8），室温避光振荡反应45分钟。</li>
	<li>加入165 µl ddH2O。</li>
	<li>加入10 µl 0.1 µg/µl的测序级修饰胰蛋白酶溶液（用50 mM碳酸氢铵缓冲液，pH 7.8重悬）。37 °C水浴孵育过夜，通过冷冻样品终止消化反应。将消化产物储存于-20 °C，待后续分析。</li>
</ol>
3. 质谱肽段检测的优化
<ol>
	<li>将待优化肽段的序列复制并粘贴到合适的软件中， 例如， Skyline9. 点击肽段序列以获取预期的前体离子质量和产物离子信息。</li>
	<li>将多肽从储备浓度（见第2.1节）进一步稀释至1 ng/ml浓度，用于质谱方法开发。</li>
	<li>以优化的流速（通常为 0.1 - 0.8 ml/min）将肽段直接注入质谱仪，并设置 0 - 5% 的碰撞能量。</li>
	<li>获取质谱以鉴定实验中的多重带电前体离子8选择产生最强信号强度的前体离子（m/z）（建议选择双电荷或三电荷的前体离子）。</li>
	<li>将肽段重新注入，并施加碰撞能量，通过碰撞诱导解离（CID）使肽段碎裂。优化锥电压和碰撞能量，以获得最佳的碎裂图谱（建议产生单电荷或双电荷的碎片离子，且碎片离子质荷比宜大于母离子）。</li>
	<li>验证实验获得的跃迁与生成的跃迁是否匹配 in silico （如步骤3.1所述）。在MRM方法文件中，为每个前体离子至少保存两条强度最高的过渡离子对。在最终检测方法中应包含两条过渡离子对：1条用于定量，1条用于确证。 
	注意：某些质谱仪制造商提供一项功能（即，Waters Intellistart）以优化自动 MRM 或 SRM 分析。如有可能，使用含 0.1% 甲酸的 50–70% 乙腈水溶液作为流动相，共同进样肽段。</li>
</ol>
4. 液相色谱-多反应监测方法开发
注意：使用超高效液相色谱（UPLC）系统联用三重四极杆质谱仪分析合成肽的混合物。确保离子源洁净。流动相A为含0.1%甲酸的ddH2O；流动相B为含0.1%甲酸的乙腈（ACN）。
<ol>
	<li>使用配备有填充C-18相（1.6 µm直径，90 Å孔径，2.1 mm x 50 mm长度）的UPLC色谱柱及相同填料预柱的LC-MS系统。</li>
	<li>将脑脊液（CSF）酶解产物置于冰上解冻，以16,000 g离心10分钟，转移60 µl至300 µl玻璃插入式样品瓶中，其余样品立即放回-20oC保存。</li>
	<li>进样标准曲线中最高浓度点，采用10分钟1–40%乙腈（ACN）线性梯度洗脱（梯度设置见表1）。</li>
	<li>打开所得色谱图，记录每种肽段在步骤3中生成的所有跃迁中信号最强的两个（定量）跃迁及其保留时间。</li>
	<li>根据上述信息，更新在步骤3.6中建立的10分钟MRM方法，设置时间分段通道以检测肽段（示例见图2）。为保持灵敏度，每个通道每峰采集点数应超过8个，且每种肽段至少一个跃迁的驻留时间大于0.01秒。</li>
	<li>在MRM方法中加入“溶剂延迟”：一个设置在首个峰洗脱前10秒之前的方法起始阶段，另一个设置在方法结束阶段，即最后一个峰洗脱后20秒。可通过在质谱方法文件中的方法事件中选择“溶剂延迟”来实现。</li>
	<li>通过定时MRM方法运行标准曲线，检查各跃迁（在步骤3.6中生成）是否存在干扰性非特异性峰，并通过线性度评估确认方法可靠性。</li>
	<li>通过将未加标混合对照和疾病脑脊液样本运行该方法，判断肽段是否可被检测。</li>
	<li>从检测方法中剔除低于检测限的肽段。</li>
</ol>
<img alt="显示用于肽分析的质谱实验的 MRM 方法设置示意图。" src="/files/ftp_upload/54541/54541fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 动态 MRM 质谱方法示例。 肽段跃迁的时间通道可根据已确定的保留时间进行分组。在目标标记肽段从色谱柱洗脱时，以时间分段的方式将多反应监测（MRM）纳入检测过程，可减少特定时间段内的跃迁数量，从而提高检测的灵敏度。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54541/54541fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 添加内标
注意：如先前所述10，可在检测中加入稳定同位素标记的内标。由于这些标准品成本较高，建议首先评估基质中的肽段。
<ol>
	<li>确定在脑脊液（CSF）中检测优化的理想肽段：选择最常出现、信号强度最高且无干扰峰的肽段。</li>
	<li>设计相应的肽段，使其包含重同位素标记的13C15N氨基酸，使标记肽段的质量相比内源性肽段至少增加6 Da。同时，在重肽段的N端或C端添加4–6个额外氨基酸的标签，以监控胰蛋白酶消化效率。</li>
	<li>将稳定同位素标记的内标用消化缓冲液稀释（参见步骤2.4）。根据前期开发过程中观察到的丰度水平，通过添加不同浓度的内标，确定在脑脊液中加标的最佳内标用量，目标是使稳定同位素标记内标与内源性肽段的比值接近1:1。 
	注：稳定同位素标记的内标可由多家商业公司合成。</li>
</ol>
6. 脑脊液患者样本的液相色谱-多反应监测检测
<ol>
	<li>向 100 µl 脑脊液（CSF）中加入适量的稳定同位素标记内标，混合后进行冷冻干燥。</li>
	<li>将脑脊液样品重悬于 20 µl 消化缓冲液中，并按照步骤 2.7 - 2.10 所述方法进行消化处理。</li>
	<li>采用第 4 步开发的液相色谱-多反应监测（LC-MRM）方法对样品进行分析。</li>
	<li>进行定量分析时，将标准肽段按 0 - 15 pmol 的浓度梯度制备标准曲线。标准曲线的配制方法见步骤 2.5。</li>
</ol>
7. 数据分析
注意：定量数据基于内标（重标记肽段）的基线峰强度比值。关于SRM/MRM数据分析的详细信息此前已有描述10。随后可利用标准曲线中的比值数据确定绝对含量，或根据添加的重标记肽段浓度进行计算。
<ol>
	<li>使用质谱仪制造商的标准软件分析液相色谱-多反应监测（LC-MRM）数据10. 或者，使用 Skyline 软件分析定量 MRM 数据10.</li>
	<li>通过检测每次运行中内标（如添加的酵母烯醇化酶或稳定同位素标记的标准品）的响应情况，检查运行的灵敏度。确保变异系数（CV）不超过25%。</li>
	<li>手动审查数据注释以确保准确性。分析每种肽段及其与相应稳定同位素标记内标的比例。 即， 如果可获得，使用该肽段的稳定同位素标记版本。</li>
	<li>获得每皮摩尔（pmol）的绝对值 100 µl 根据同时运行的标准曲线对脑脊液（CSF）的比值数据进行分析。</li>
	<li>计算变异系数（CV）。每种肽段的CV应低于25%，高丰度肽段的CV应低于15%。 
	注意：每皮摩尔的绝对值 100 µl 脑脊液数值可用于后续的统计学分析。</li>
</ol>
8. 载脂蛋白E亚型状态
注意：为了确定载脂蛋白E（ApoE）亚型状态，可通过检测各亚型相应肽段的存在来完成。
<ol>
	<li>以脑脊液（CSF）100 µl 中 ApoE 的信噪比 > 1,000 作为该肽段阳性的判断阈值。确定患者等位基因型所需/缺失的肽段信息参见图5。通过计算每种异构体占总 ApoE 表达的百分比来确定等位基因表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Prince, P. M., Guerchet, D. M., Prina, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPrince%2C+PM+%22Policy+Brief%3A+The+Global+Impact+of+Dementia+2013-2050%22">Policy Brief: The Global Impact of Dementia 2013-2050</a>. , Alzheimers Disease International. Available from: 
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

与所有基于质谱的检测方法一样，该方法的关键步骤在于确定内标物的适当且准确的用量。如果采用绝对定量，则标准曲线中加入的肽段的正确用量也至关重要。
我们的检测方法在质谱分析前无需对脑脊液进行沉淀处理，也无需使用任何净化或脱盐步骤。&#160;这是一种完全的单容器反应方法。由于脑脊液（CSF）体积小且复杂性较低（相较于血浆），研究发现这些步骤可从最终方案中省略。&#160;从而简化了检测流程，并使其更适用于转化应用&#160;诊断环境。在主分析柱前连接预柱&#160;溶剂在质谱方法中的延迟出现&#160;足以在质谱运行过程中维持超过500个样本的检测灵敏度。由于该检测方法的超高效液相色谱运行时间较短，因此在脑脊液消化基质中明确鉴定出正确色谱峰至关重要。
这只能通过使用加标合成肽段和标准曲线来实现。如果对肽段是否匹配到正确的色谱峰存在不确定性，则可能需要&#160;将样品通过多个跃迁通道，并利用合成标准品比对跃迁强度模式。我们的所有检测均包含至少两条肽段跃迁通道，以确认肽段的身份。
<p class="jove_content...

阿尔茨海默病、路易体痴呆和帕金森病等神经退行性疾病日益增长的影响正在成为许多国家的社会经济问题1。目前亟需更多&#160;生物标志物，用于在疾病早期阶段识别和分类患者，&#160;并监测任何潜在的新疗法。本方法的总体目标是建立一个通用的流程，以更高效、经济且快速的方式验证神经退行性疾病的潜在脑脊液标志物。其原理是采用靶向蛋白质组学或肽段多重反应监测液相色谱-串联质谱法（MRM LC-MS/MS），作为一种易于调整的方法，用于评估来自&#160;发现阶段实验的多种潜在蛋白质生物标志物。这些标志物可在快速色谱分离（&#60;10 分钟）过程中进一步实现多重检测与分析。在此项针对神经退行性生物标志物的多重筛查中，我们纳入了已知的痴呆风险因子载脂蛋白 E4 同工型（ApoE4），从而可同时确定其状态和表达水平，由此避免了单独进行基因分型检测的需要2。液相色谱-串联质谱法（LC MS/MS）通常被作为首选方法，用于对小分子进行精确定量，相较于 ELISA 或放射免疫分析法（RIA）等其他方法更具优势。质谱技术在蛋白质分析中的应用转变，主要由基于免疫的技术所存在的问题推动，这些问题包括交叉特异性、批次间差异、保质期有限以及成本高昂。因此，靶向蛋白质组学正迅速成为抗体依赖方法（如 Western blot、RIA 和 ELISA）的一种重要替代方案。然而，该技术相较于免疫学方法的主要优势在于能够将多个标志物整合到一次检测中3。该技术适用于多种组织样本，并已被广泛用作蛋白质组学研究的验证策略，包括血浆4和尿液5,6中的标志物验证。
该技术可应用于任何具备三重四极杆质谱仪使用条件和相关专业技术的实验室。随着开源数据库的广泛应用，肽段设计已变得相对简单。定制肽合成市场的竞争日益激烈&#160;使其价格大幅降低&#160;。然而，重标肽价格仍然较高，因此在扩大规模之前，应先在小样本队列中&#160;对标志物进行评估&#160;。该技术在临床诊断领域具有广阔的应用前景，大多数大型医院均已配备基于三重四极杆的平台&#160;，可轻松改造用于开展靶向蛋白质组学检测。该方法的一项实际应用是已进入常规诊断领域，例如近期将其用于新生儿干血斑筛查镰状细胞贫血7。

<table><tbody><tr><td>乙腈（ACN），LC-MS 级&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，LC-MS 级</td><td>Fisher</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>D5545 - 5 g</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，37% w/w</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>BDH3028 - 2.5 LG</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>I1149 - 5 g</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，测序级，经修饰</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸（TFA），LC-MS 级</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U0631- 500 g</td><td></td></tr><tr><td>水，LC-MS ULTRA Chromasolv</td><td>Fluka</td><td>14263</td><td></td></tr><tr><td>定制合成的脱盐肽段，1–4 mg</td><td>Genscript</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>重同位素标记氨基酸[&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C; &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N] 定制肽段</td><td>Genscript</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>ASB 14</td><td>Merck Millipore</td><td>182750 - 25 g</td><td></td></tr><tr><td>硫脲</td><td>Sigma</td><td>T7875 - 500 g</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>VanGuard 预柱</td><td>Waters</td><td>186007125</td><td></td></tr><tr><td>Cortecs UPLC C18 + 1.6 &amp;#956;m&amp;nbsp; 2.1 x 50 mm 色谱柱</td><td>Waters</td><td>186007114</td><td></td></tr><tr><td>酵母烯醇化酶&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E6126</td><td></td></tr><tr><td>300 &amp;#956;l 透明螺口玻璃小瓶</td><td>Fisher scientific</td><td>03-FISV</td><td></td></tr><tr><td>Y 型切口螺帽&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>9SCK-(B)-ST1X</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Edwards Mudulyo&amp;nbsp;</td><td>Mudulyo system</td><td></td></tr><tr><td>浓缩仪/真空离心浓缩仪</td><td>Eppendof&amp;nbsp;</td><td>concentrator&amp;nbsp;plus 5301</td><td></td></tr><tr><td>Xevo -TQ-S 质谱仪</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC 系统</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白e亚型状态

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

许多神经退行性疾病是&#160;仍然缺乏 有效治疗方案可靠的生物标志物对于识别和分类这些疾病在开发未来新型疗法中具有重要意义。通常&#160;潜在的新生物标志物未能成功应用&#160;进入临床&#160;由于存在局限性&#160;在其发育过程中&#160;高成本。&#160;然而，&#160;使用三重四极杆质谱仪的多重反应监测液相色谱-串联质谱法（MRM LC-MS/MS）是一种可用于快速评估和验证生物标志物的靶向蛋白质组学方法&#160;用于临床转化至诊断实验室。传统上，该平台已广泛用于小分子的检测&#160;在临床实验室中，尽管该技术具有分析蛋白质的潜力，使其成为基于ELISA（酶联免疫吸附测定）方法的一种有吸引力的替代方案。本文描述了如何利用靶向蛋白质组学来检测和定量包括已知风险因子载脂蛋白E4同工型（ApoE4）在内的多种痴呆标志物。
为了使该检测方法适用于转化研究，其设计需具备快速、简便、高度特异且成本效益高的特点。为实现这一目标，必须针对所分析的特定蛋白质和组织，优化检测方法开发过程中的每一步。本方法描述了一个典型的工作流程，包括开发用于转化研究的靶向蛋白质组学MRM LC-MS/MS的多种技巧与注意事项。
通过使用定制合成的胰蛋白酶特征性定量肽进行方法开发和优化，这些肽用于校准&#160;质谱仪以实现检测，随后被添加到脑脊液（CSF）中，以在质谱分析前确认内源性肽在色谱分离过程中的正确鉴定。为实现绝对定量，检测中还包含了带有短氨基酸序列标签并含有胰蛋白酶切割位点的稳定同位素标记内标肽段。

采用上述方法，开发了一种高通量、耗时10分钟的多重检测方法，包含来自54种蛋白质的74种肽段，用于检测神经退行性疾病阿尔茨海默病和路易体痴呆（LBD）的标志物8。图3展示了此前发表的该检测中关键肽段标志物的多重色谱图8。检测所包含的肽段及其定量离子转换信息见表2。该方法生成的数据为相对于相应稳定同位素标记内标的标准比值，这些数值可通过标准曲线换算为脑脊液（CSF）中绝对的pmol/100 µl浓度，并进一步对临床样本中的变化进行统计学分析。
如先前所述8，对该脑脊液（CSF）检测中包含的74种肽段进行定量分析后发现，其中25种生物标志物在痴呆症患者脑脊液中的水平发生显著改变。为说明本检测方法的有效性，图4展示了先前报道的痴呆相关标志物前食欲素（Pro-Orexin）和几丁质酶3样蛋白（Y...

我们描述了一种高通量、多重靶向的脑脊液（CSF）蛋白质组学检测方法，具有临床转化潜力。该检测可定量神经退行性变的潜在标志物和风险因素，例如载脂蛋白E的变异体（E2、E3和E4），并测量其等位基因表达水平。

一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

许多神经退行性疾病仍然缺乏有效的治疗方法。用于识别和分类这些疾病的可靠生物标志物将有助于……

本方法的总体目标是快速且经济地定量脑脊液（CSF）中的多种生物标志物，以评估其在诊断和治疗监测中的应用价值。这是一种新型检测方法，使我们能够测量以往无法检测的生物标志物。我们认为该方法可用于诊断目的，还可用于区分不同的神经退行性疾病，并可能提供预后信息。该技术的主要优势在于其设计具有快速、样品制备简单、高度特异性和成本低廉的特点，易于转化为临床实验室应用。该技术的应用前景涵盖治疗与诊断领域，因为这种高通量检测方法可在未来的临床试验中用于神经退行性疾病的新型疗法研究。该方法还可应用于其他疾病和组织样本，例如尿液用于肾脏疾病、血浆用于心肌病，以及细胞用于多能性检测。开始此实验步骤时，根据制造商说明书将所需合成多肽重悬至1毫克/毫升的储存浓度。从该储存浓度中对多肽进行10倍稀释，并将每种多肽各1,000皮摩尔汇集至一个低吸附微量离心管中。使用SpeedVac浓缩仪将汇集的多肽样品干燥。完成后，将样品在零下20摄氏度保存。接下来，将100微升脑脊液分装至低吸附的微量离心管中。冻干脑脊液样品。将混合肽样品的等分试样重悬于消化缓冲液中，配制成浓度分别为每微升10皮摩尔和1皮摩尔的溶液。随后，将混合肽样品以0、1、2、5、10和15皮摩尔浓度添加至100微升冻干脑脊液等分试样中。然后，加入20纳克完整且无相关的蛋白质，作为内标物并用于监控胰蛋白酶的消化效率。向脑脊液分装样品中加入消化缓冲液，使终体积达到 20 微升，并涡旋混匀样品。随后，加入 1.5 微升二硫苏糖醇，按照标准操作程序在室温下振荡反应一小时。接着，向样品中加入 3 微升碘乙酰胺，在避光条件下于室温振荡 45 分钟。然后，加入165 µL双蒸水。向样品中加入10 µL浓度为0.1 µg/µL的测序级修饰胰蛋白酶溶液，该溶液用50 mmol/L碳酸氢铵缓冲液重悬。将样品置于37 °C水浴中孵育过夜。然后，通过冷冻样品终止消化反应。将脑脊液消化产物在冰上解冻后，以16,000 × g离心10分钟。离心结束后，将每份消化产物60 µL转移至300 µL玻璃插入管中。使用配备C18 UPLC色谱柱的液相色谱-质谱（LC-MS）系统，采用10分钟、乙腈浓度从1%线性梯度升至40%的洗脱程序，进样标准曲线中最高浓度点。运行完成后，在软件中打开相应的色谱图，记录每种肽段的保留时间及其信号强度最高的两个碎片离子跃迁。根据这些信息，更新先前建立的多重反应监测（MRM）方法，添加时间分段通道以检测目标肽段。为了保持灵敏度，每个通道应确保每种肽段至少有一个跃迁的峰点数超过八个，且驻留时间大于 0.01 秒。在质谱方法文件中，通过在方法事件中选择溶剂延迟，将溶剂延迟纳入 MRM 方法中。在短时间高效液相色谱方法中，正确匹配相应的色谱峰至关重要。可通过使用基质中用于标准曲线的加标肽段，并在方法开发过程中观察多个 transitions 来实现。最后，手动审查数据注释以确保准确性。对每种肽段及其与相应稳定同位素标记内标物的比值进行分析。此处展示了高通量脑脊液（CSF）检测中显著肽类标志物的色谱图。该数据提供了相对于相应稳定同位素标记的内标物的标准化比值，可用于确定脑脊液中绝对浓度，并对临床样本中的变化进行统计学分析。对该CSF检测中包含的74种肽段进行定量分析发现，其中25种在痴呆患者脑脊液中发生显著改变，此处展示了痴呆标志物前食欲素（pro-orexin）和YKL几丁质酶-3样蛋白的检测结果。ApoE4 是阿尔茨海默病的已知风险因素，ApoE 亚型的检测基于检测对应于 E2 和 E4 亚型氨基酸变化的肽段。此处显示了每种亚型组合所预期的质谱峰图。一旦方法建立，若操作得当，该检测可在一天内完成。该方法开发后，已能够以高分析灵敏度和特异性测量一组新的生物标志物，这将使研究人员能够以全新的方式评估神经退行性疾病。观看本视频后，您应能够充分理解如何设计并优化 MRM 检测方法的灵敏度与特异性。请注意，操作 DTE、白蚁、甲酸及人体组织时可能存在极高危险性，因此在实验过程中应采取预防措施，例如佩戴手套。

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高通量，复用和有针对性的蛋白质组学分析脑脊液量化神经退行性生物标志物和载脂蛋白E亚型状态

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一种高通量、多重靶向蛋白质组学脑脊液检测方法，用于定量神经退行性生物标志物及载脂蛋白E亚型状态

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