野生型封闭 PCR 检测低频体细胞突变

野生型阻断聚合酶链反应，或WTB-PCR通过选择性扩增低丰度突变等位基因来检测点突变，同时抑制DNA样品中高丰度野生型等位基因的扩增。

WTB-PCR 利用锁定的核酸，或含有 LNA 的单链修饰寡核苷酸，与样品的野生型 DNA 链互补，与互补链特异性结合。LNA结合阻断DNA聚合酶的活性，抑制野生型模板DNA的伸长。

要进行WTB-PCR，请在无核酸酶蒸馏水中取含有dNTP，LNA和靶标特异性正向和反向引物的预混液。

管中加入含耐热DNA聚合酶的溶液，并将混合物移液到PCR板的孔中。将含有野生型和突变型DNA的基因组DNA样品加入孔中，然后开始PCR。

PCR 过程中，高温介导的变性分离双链 DNA。分离的链充当引物退火的模板，而LNA与其互补的野生型DNA链结合并形成阻断剂-野生型DNA杂交体。在较高温度下，DNA 聚合酶添加 dNTP 并延伸引物 DNA 模板。

LNA-DNA 杂交体的熔化温度高于 DNA-DNA 复合物，使其保持完整。LNA 的修饰最终会阻止 DNA 聚合酶延伸 LNA-DNA 杂交体，从而抑制其伸长。

在几个 PCR 循环中，LNA 介导的阻断增加了相对于样本中野生型变体的突变型扩增子的数量，有助于选择性检测。

正向和反向引物采用 5'-M13 序列设计，以允许对互补测序引物进行退火。将封闭寡核苷酸设计为长度约为10至15个碱基，并与需要突变富集的野生型模板互补。

较短的寡核苷酸将改善错配歧视。为了实现高靶标特异性，重要的是不要使用过多的封闭核苷酸，因为这会导致非常"粘性"的寡核苷酸。

要设计封闭寡核苷酸，请首先导航到 Oligo Tools 网站。选择"寡核苷酸 T_M 预测"工具。将打开一个新窗口。将要阻断的野生型模板的序列粘贴到"寡核苷酸序列"框中。在阻挡器底座前面添加一个加号来标记它们。单击"计算"按钮以确定 DNA 阻断剂杂交体的近似 T_M。计算出的熔化温度将显示在下面的框中。

设计封闭寡核苷酸，使其熔化温度比热循环期间的延伸温度高出 10 至 15 摄氏度。这里，延伸温度为72摄氏度。要调整熔化温度，请添加、移除或替换封闭基。避免长时间拉伸三到四个阻挡 C 或 G 碱基。

接下来，为避免二级结构形成或自二聚化，请返回 Oligo Tools 网站主屏幕并选择"Oligo Optimizer"工具。将打开一个新窗口。将要阻塞的野生型模板的序列粘贴到框中。添加一个加号以指示阻塞碱基。选择"二级结构"和"仅自身"两个框，然后按"分析"按钮查看杂交和二级结构的分数。

这些分数分别代表了对自二聚体和二级结构熔化温度的非常粗略的估计。较低的分数是最佳的，可以通过限制阻滞剂-阻滞剂配对来实现。去除或重新定位阻断核苷酸以获得较低的分数。此处所示的 MyD88 优化的封闭寡核苷酸在 DNA 阻断剂杂交熔解温度与足够低的杂交和二级结构评分之间取得了平衡。

它旨在覆盖氨基酸 Q262 至 I266，并具有 3'-反转 dT，可抑制 DNA 聚合酶的延伸和 3'-核酸外切酶的降解。设计引物后，设置野生型封闭PCR并执行热循环，如随附文档所述。