Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

该程序的总体目标是描述一个用于对具有挑战性的癌症标本进行测序的综合系统，该系统结合了湿实验室试剂、标准化对照和独立的生物信息学套件。该方法可以帮助回答癌症领域的关键问题，例如如何对低数量和低质量的肿瘤活检进行测序以实现准确的 DNA 变异分析和解释。这种方法的主要优点是，难以测序的样品是那些仅具有有限 DNA 数量的样品，可以使用单一来源试剂和对照以及完全集成的生物信息学软件进行快速可靠的分析。

一般来说，由于靶向 NGS 的复杂性，刚接触这种方法的个体会遇到困难，而这种方法简化了这种方法。但是，需要特别注意文库定量和样品混合的程序，以实现所有样品文库的均匀覆盖。该方案集成了湿法和干法工作台工艺，用于对具有挑战性的癌症标本进行测序。

第一步是 DNA 的定量和定性，以确定可通过实时荧光定量 PCR 扩增的 DNA 模板拷贝数。通过在微量离心管中制备足够量的预混液来开始样品定量和质量控制程序。每个样品使用以下体积：5 微升 2x 预混液、0.5 微升引物探针混合物、0.5 微升抑制引物探针混合物、0.05 微升 ROX 和 2.95 微升稀释剂。

将 9 微升预混液添加到 96 孔板的每个孔中。加入 1 μL DNA 标准品，一式两份，上下吹打 5 次混匀。确保核酸样品充分混合后，将 1 微升样品加入预混液中，上下吹打 5 次混匀。

将密封板放入 PCR 系统中。在 95 摄氏度下执行 10 分钟的 PCR 循环，然后在 95 摄氏度下执行 40 个循环，每个循环为 15 秒，在 60 摄氏度下执行 1 分钟。通过为每个重复的 DNA 标准品生成线性回归图来分析 qPCR 数据。

然后按照方案文本中的描述计算每微升功能性或可扩增拷贝数的未知 DNA 的浓度。样品定量和质量控制后的下一步是通过单管多重 PCR 富集癌症热点序列。将进行基因特异性或 gsPCR，以富集 21 个癌症基因中的 46 个位点。

样品使用以下体积、5 μL 2x 扩增预混液和 1 μL 泛癌种引物组合，在微量离心管中制备足量的 gsPCR 预混液。将 6 μL gsPCR 预混液分装到 96 孔板的每个孔中。将 4 μL 的每种核酸样品加入到各个孔中。

通过上下吹打 5 次来混合。包括相应的控件。将密封板放入热循环仪中进行以下 PCR 循环。

95 摄氏度 5 分钟。95 摄氏度 15 秒，然后 60 摄氏度 4 分钟，共两个周期。95 摄氏度 15 秒，然后 72 摄氏度 4 分钟，共 23 个周期。

最后一次在 72 摄氏度下延长 10 分钟，然后在 4 摄氏度保持。基因特异性 PCR 后，进行 10 个循环的标签 PCR，以掺入平台特异性接头，以便与下一代测序兼容。将 7.5 微升 2x 指数预混液和 5.5 微升指数代码添加到 96 孔板中的指定孔中，并通过上下吹打 5 次进行混合。

小心打开 gsPCR 板，将 2 μL gsPCR 产物添加到含有预混液的新板中。将密封板放入热循环仪中进行以下 PCR 循环，在 95 摄氏度下 5 分钟，在 95 摄氏度下 30 秒，在 55 摄氏度下 30 秒，在 72 摄氏度下 1 分钟，共 10 个循环，最后在 72 摄氏度下延长 10 分钟。其次是保持在 4 摄氏度。

标签 PCR 后，使用磁珠化学完成文库纯化和大小选择。通过将 11 μL 文库纯制备磁珠添加到 96 孔板的单独孔中来开始此过程。打开 tag-PCR 板，向珠子中加入 10 μL tag-PCR 产物，上下吹打 5 次混合。

在室温下孵育混合物 4 分钟。将 96 孔板放在磁性支架上 4 分钟。在 96 孔板仍在支架上的情况下，用移液管取出并丢弃上清液。

按照实验方案文本中的说明，用含有洗涤缓冲液的乙醇洗涤珠子两次后，在室温下干燥珠子 2 分钟，然后从支架上取下板。通过向每个孔中加入 20 μL 洗脱缓冲液并上下移液 5 次来重悬珠子。在室温下孵育 2 分钟。

将 96 孔板放回磁力架上 4 分钟，然后小心取出 18 μL 透明上清液，并将其转移到新的 96 孔板中的孔中。该方案的下一步是通过相对竞争性实时 PCR 对每个纯化的样品库进行定量。要开始此过程，请使用每个样品的以下体积在微量离心管中制备足够量的 LQ 预混液：5 微升 2x LQ 预混液、2 微升 LQ 引物探针混合物、0.5 微升 LQ 标准品和 0.5 微升 LQ ROX。

将 8 μL LQ 预混液添加到光学 96 孔板的孔中。在单独的孔中，加入 2 微升连续稀释的文库、2 微升 LQ 阳性对照和 2 微升 LQ 稀释剂，并通过上下移液 5 次进行混合。将密封板放入 PCR 系统中，并为每个样品分配 FAM 和 VIC 检测器。

使用以下循环条件进行 PCR 扩增：在 95 摄氏度下 5 分钟，在 95 摄氏度下 15 秒，然后在 60 摄氏度下 1 分钟，共 40 个循环。然后按照方案文本中的说明计算每个样品的浓度。文库定量后，根据其测量的浓度对每个样品文库进行归一化，并汇集到单个试管中进行测序。

使用简化的分析模块来促进库归一化和样本池的计算。要归一化文库，首先确定所有样品的纳摩尔中位浓度，每个样品都包含要合并的唯一成对索引。接下来，将所有样品的中位浓度乘以 5，然后除以其单个浓度，以确定要合并的单个样品体积（以微升为单位）。

将每个样品的标准化体积添加到单个微量离心管中，以创建样品池。使用测序稀释剂将样品池稀释至 1.25 纳摩尔。通过在 phix 对照 V3 存在下变性来准备用于测序的样品池。将以下物质混合：15 微升 1.25 纳摩尔样品池、3 微升 0.5 纳摩尔 phix 和 2 微升 1N 氢氧化钠。

短暂涡旋和离心后，在室温下孵育 5 分钟。在微量离心管中，将 8 微升变性文库添加到 992 微升预冷的 HT1 高缓冲液中。将 600 μL 变性稀释的文库添加到试剂盒的 17 号位置。

在微量离心管中，用 636 μL HT1 高缓冲液分别稀释 4 μL 每种测序引物。将 600 微升稀释的 read-1 测序引物添加到测序试剂盒的 18 号位置。将 600 μL 稀释的索引读取引物添加到编号 19 的位置，将 600 μL 稀释的读取-2 测序引物添加到位置 20。

将试剂加载到下一代测序仪器上，并根据制造商的说明进行配对末端、2 x 150 循环测序运行。最后，使用配套的生物信息学软件分析测序数据。使用台式测序仪，在单次 NGS 运行中总共可处理 90 个样品。

对于所示的数据集，样品包括细胞系、残留的临床正式和固定石蜡包埋 （FFPE） 以及合成模板 DNA，并实现了高深度测序和均匀覆盖。异常值由无模板对照、具有大拷贝数扩增的单细胞系 DNA 稀释系列和一个通过基于分析前 qPCR 的 QC 分析标记为 PCR 抑制的 FFPE DNA 组成。使用三种不同的作员和不同的低质量 FFPE DNA 样品保持 46 个扩增子的覆盖均一性。

在 FFPE 肿瘤中，由已知的 5% BRAF V600E 突变组成的 DNA 对照混合物报告，由三名作员使用 400 个可扩增拷贝的起始量具有 5.2% 或负 1.3% 的靶标 BRAF 突变。细胞系和 FFPE DNA 样品的稀释液与拷贝数扩增证明对 EGFR 和 KRAS 扩增具有依赖性。重要的是，FFPE DNA 起始量可以减少到 50 个可扩增拷贝或 1.2 ng 的大量 DNA。

同时保留对已知突变的检测，没有任何误报检出。一旦掌握了这项技术，如果执行得当，可以在 11 小时内完成，大约需要三个半小时的手动作时间，一次批量为 24 个样品。