湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本实验的总体目标是描述一种综合性测序系统，用于对具有挑战性的癌症样本进行测序，该系统结合了湿实验试剂、标准化对照以及独立运行的生物信息学分析套件。该方法有助于解决癌症研究领域中的关键问题，例如如何对DNA含量低且质量差的肿瘤活检样本进行测序，以实现准确的DNA变异分析与解读。该方法的主要优势在于，对于那些因DNA起始量有限而难以测序的样本，可利用单一来源的试剂与对照，结合完全整合的生物信息学软件，快速且可靠地完成分析。

初学者通常会因靶向 NGS 技术的复杂性而遇到困难，而本方法可简化该过程。然而，文库定量和样本混合的步骤需要特别注意，以确保所有样本文库间的测序覆盖均匀。本方案整合了湿实验与干实验流程，用于处理具有挑战性的癌症样本测序。

第一步是进行 DNA 的定量与定性分析，以确定可通过实时 PCR 扩增的 DNA 模板拷贝数。开始样品定量与质量控制操作时，先在微量离心管中配制足量的预混液。每份样品使用以下体积：5 微升 2x 预混液、0.5 微升引物探针混合液、0.5 微升抑制剂引物探针混合液、0.05 微升 ROX 和 2.95 微升稀释液。

向96孔板的每个孔中加入9微升主混合液。每个DNA标准品重复加入两个孔，每孔1微升，并通过上下吹打五次混匀。确保核酸样品充分混匀后，取1微升样品加入主混合液中，并通过上下吹打五次混匀。

将密封的反应板放入PCR仪中。进行PCR扩增，程序为：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和60 °C退火延伸1分钟。通过为每份重复的DNA标准品生成线性回归曲线来分析qPCR数据。

随后根据方案文本所述，计算未知DNA在每微升中的功能拷贝数或可扩增拷贝数浓度。在完成样本定量与质量控制后，下一步是通过单管多重PCR富集癌症热点序列。将采用基因特异性PCR（gsPCR）对21个癌症基因中的46个位点进行富集。

在微量离心管中配制足够量的gsPCR预混液，每份样本使用5微升2x扩增预混液和1微升泛癌引物组。将6微升gsPCR预混液分装至96孔板的每个孔中。向各孔分别加入4微升每种核酸样本。

用移液器上下吹打混合5次。设置适当的对照。将密封的板放入热循环仪中，进行以下PCR循环。

95摄氏度下5分钟。95摄氏度下15秒，随后60摄氏度下4分钟，进行2个循环。95摄氏度下15秒，随后72摄氏度下4分钟，进行23个循环。

在72摄氏度下最终延伸10分钟，随后在4摄氏度下保存。基因特异性PCR完成后，进行10个循环的标签PCR（tag-PCR），以引入适用于下一代测序平台的特异性接头。向96孔板中指定孔加入7.5 µL的2×索引主混合液和5.5 µL的索引编码序列，通过上下移液5次混匀。

小心打开gsPCR板，将两微升gsPCR产物加入含有预混液的新板中。将密封好的板放入热循环仪，进行以下PCR循环：95°C下5分钟，95°C下30秒，55°C下30秒，72°C下1分钟，共10个循环，最后在72°C延伸10分钟，随后在4°C保存。

在完成标签PCR后，使用磁珠化学方法进行文库纯化和片段大小选择。首先，在96孔板的各个孔中分别加入11微升文库纯化磁珠。打开标签PCR反应板，将10微升标签PCR产物加入磁珠中，并用移液器上下吹打5次以充分混匀。

将混合物在室温下孵育4分钟。将96孔板置于磁力架上4分钟。保持96孔板仍在磁力架上，用移液器吸除并弃去上清液。

按照方案文本所述，用含有洗涤缓冲液的乙醇洗涤磁珠两次后，在室温下将磁珠干燥两分钟，然后将酶标板从支架上取下。通过向每个孔中加入 20 µL 洗脱缓冲液并上下吹打五次，重悬磁珠。在室温下孵育两分钟。

将96孔板重新放回磁力架上静置4分钟，小心移除并转移18微升澄清上清液至新的96孔板中的一个孔内。本实验方案的下一步是通过相对竞争性实时PCR对每个纯化后的样本文库进行定量。开始此步骤时，需在微量离心管中配制足够量的LQ预混液，每份样本所需组分如下：5微升2x LQ预混液、2微升LQ引物探针混合液、0.5微升LQ标准品和0.5微升LQ ROX。

向光学96孔板的一个孔中加入8 µL的LQ预混液。在不同的孔中，分别加入2 µL文库的系列稀释液、2 µL的LQ阳性对照和2 µL的LQ稀释液，并通过上下移液5次混匀。将密封的板放入PCR系统中，并为每个样本分配FAM和VIC检测通道。

使用以下扩增条件进行PCR扩增：95摄氏度预变性5分钟，随后在95摄氏度变性15秒，60摄氏度退火延伸1分钟，共40个循环。然后根据实验方案文本中所述方法计算各样本的浓度。在文库定量完成后，根据测得的浓度对每个样本文库进行标准化，并将所有文库混合至同一管中用于测序。

使用简化的分析模块来简化文库标准化和样本混合的计算过程。为对文库进行标准化，首先确定所有样本中以纳摩尔为单位的中位浓度，每个样本均含有用于混合的独特成对索引。接下来，通过将所有样本的中位浓度乘以5，再除以各样本自身的浓度，计算出每个样本应混合的微升体积。

将每个样本的标准化体积加入同一个微量离心管中，以构建样本混合液。使用测序稀释液将样本混合液稀释至1.25 纳摩尔。通过在V3版phiX对照存在下变性，对样本混合液进行测序前处理。混合以下组分：15 微升1.25 纳摩尔的样本混合液、3 微升0.5 纳摩尔的phiX对照和2 微升1N氢氧化钠。

短暂涡旋并离心后，在室温下孵育5分钟。将8微升变性文库加入含有992微升预冷HT1高缓冲液的微量离心管中。将600微升变性并稀释后的文库加入试剂盒的第17号位置。

在微量离心管中，分别将每种测序引物各4微升用636微升HT1高缓冲液稀释。将600微升稀释后的读段1（read-1）测序引物加入测序试剂盒第18号位置，600微升稀释后的索引读段（index read）引物加入第19号位置，600微升稀释后的读段2（read-2）测序引物加入第20号位置。

将试剂加载到下一代测序仪器上，并根据制造商的说明进行双端、两轮各150个循环的测序运行。最后使用配套的生物信息学软件分析测序数据。使用台式测序仪，单次NGS运行可处理总共90个样本。

对于所示数据集，样本包括细胞系、残留的临床福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本以及合成模板DNA，均实现了高深度测序和均匀的覆盖度。异常值样本包括无模板对照、一种具有大片段拷贝数扩增的细胞系DNA的系列稀释样本，以及一个在预分析阶段基于qPCR的质量控制检测中被标记为存在PCR抑制的FFPE DNA样本。在使用三名不同操作人员以及不同低质量FFPE DNA样本的情况下，46个扩增子间的覆盖均匀性均得以保持。

在使用400个可扩增拷贝作为起始量时，三位操作人员对含有已知5% BRAF V600E突变的FFPE肿瘤DNA对照混合物进行检测，报告的目标BRAF突变平均丰度为5.2±1.3%。含有拷贝数扩增的细胞系和FFPE DNA样本的系列稀释结果显示，EGFR和KRAS的扩增具有剂量依赖性。重要的是，FFPE DNA的起始量可减少至低至50个可扩增拷贝或1.2纳克总DNA。

在不产生任何假阳性结果的前提下，实现对已知突变的准确检测。若操作得当，掌握该技术后，每次可处理24个样本的批次，总耗时约11小时，其中实际操作时间约为3.5小时。