基于纠错 DNA 和 RNA 测序的稀有事件检测方法

下一代测序 (0.5–2.0%) 是基因组特征的有力工具, 受平台高错误率的限制。我们描述了我们的错误纠正排序方法, 使我们能够避免的误差率和检测突变的变异等位基因分数罕见的0.0001。

这种方法可以帮助回答各个研究领域的一些关键问题，例如癌前克隆的检测、白血病患者治疗后的预后评估以及骨髓供体中潜在致病突变的鉴定。Spencer 将与我一起演示此程序，他是实验室的一名技术人员。本视频介绍了如何将纠错测序方案与 Illumina 化学试剂和市售基因检测组合相结合，以 10， 000 分之一的灵敏度检测克隆单核苷酸变异和小插入缺失。

为了整合所需的唯一分子标识符，定制的 16N i5 和 i7 接头使用 PCR。首先，制备 Q5 预混液，它使用的聚合酶比市售替代品的保真度更高。然后，对于每个反应，混合 37.5 μL Q5 预混液、6 μL 5 微摩尔 16N i5 接头（唯一分子标识符）和 6 μL i7 接头。

如果目标是多路复用，则在单独的示例中使用不同的 i7 适配器。现在，使用以下参数运行 PCR：98 摄氏度下 30 秒，然后是 4 到 6 个周期，98 摄氏度下 10 秒，66 摄氏度下 30 秒，72 摄氏度下 30 秒。在 72 摄氏度下延长 2 分钟，并在 4 摄氏度下保持反应。

那么你必须对它们进行的两个 PCR 循环很可能取决于你使用的基因组合的大小，根据我们的经验，如果基因组合有大约 1500 个不同的基因特异性寡核苷酸路径，那么四个循环的 PCR 就足够了，而一个有大约 5 到 600 对寡核苷酸的循环需要大约六个循环的 PCR。接下来，使用磁珠净化 PCR 反应，向每个 75 微升 PCR 产物中加入 56.25 微升磁珠溶液，然后将每个反应转移到单独的 1.5 毫升低结合管中，通过上下吹打至少 10 次混合，并等待 5 分钟。接下来，将混合物转移到磁性支架上，让上清液澄清 2 分钟。

然后，去除并丢弃上清液。接下来，加入 200 微升 70% 乙醇，等待 30 秒，然后去除乙醇。重复此乙醇洗涤步骤一次，然后让磁珠风干 5 分钟。

最后，在 20 微升双蒸水中从珠子中洗脱修饰的文库。然后，将试管放在磁架上，以将磁珠与洗脱液分离。首先，将上一步中的 ECS 文库进行 10 倍连续稀释，在 PCR 条中降至每 1， 000

接下来，在 1.5 mL 试管中制备预混液。对于每个反应，混合 10 μL ddPCR EvaGreen Mix、0.2 μL P5 引物、0.2 μL P7 引物和 4.6 μL 双蒸水。然后，将 15 微升 EvaGreen 预混液移液到一组新的试管中，最后将 5 微升 1 比 1， 000 ECS 净化产物添加到预混液中。

接下来，使用液滴发生器制备 PCR 液滴。首先，装入盒中，将 70 微升液滴发生油移入盒孔中，标油，然后将 20 微升 ddPCR 反应混合物移液到贴好样本中。然后，用橡胶垫圈盖住凝胶盒，将其加载到液滴发生器中，然后继续产生所有液滴。

现在，使用多通道移液管，缓慢地，超过 5 秒，将从每个盒孔中取出的 45 μL 液滴加载到新的 PCR 板上。然后，用铝箔密封 PCR 板。现在，使用以下条件放大液滴中的信号：在 95 摄氏度下 5 分钟，然后在 95 摄氏度下循环 40 秒，在 63 摄氏度下循环 1 分钟，然后将反应冷却到 4 摄氏度 5 分钟，然后再将其升高到 90 摄氏度 5 分钟， 然后保持在 4 摄氏度。

接下来，准备 ddPCR 模板微滴读取器机器。选择用于绝对定量的参数，并使用 QX200 ddPCR EvaGreen 超混合液。然后，通过微滴检测仪运行反应。

ddPCR 分析完成后，对每个样品应用相同的分裂阈值。然后，将每个文库归一化为所需的分子数。首先进行 50 μL 反应，包括 25 μL Q5 预混液、2 μL 1 微摩尔 P5 引物、2 μL 1 微摩尔 P7 引物和 21 μL 归一化 DNA 文库。

接下来，使用以下参数运行 PCR：在 98 摄氏度下运行 30 秒，然后是 16 个周期，在 98 摄氏度下 10 秒，在 66 摄氏度下 30 秒，在 72 摄氏度下运行 30 秒，然后在 72 摄氏度下运行 2 分钟，并保持在 4 摄氏度。接下来，定量文库中 DNA 的浓度，并以等摩尔量汇集文库进行测序，靶向大约 4 纳摩尔。现在，使用 Illumina 测序平台对合并的 ECS 文库进行测序，测序设置如下：2 次双端读长，索引 1 的 8 个循环和索引 2 的 16 个循环。

GATA1 突变患者的 DNA 以原始 VAF 0.19 在商业基因组 DNA 中稀释。使用所描述的方案，ECS 被证明对单核苷酸变体的定量水平为 1 到 10， 000。接下来，使用由 568 个扩增子组成的商业测序面板分析来自 20 名健康个体的血沉棕黄层样本。

总之，在至少一个收集时间点的两个重复中存在 109 个克隆体细胞突变，变异等位基因分数范围为 0.0003 至 0.1451.21 个具有已知宇宙表征的突变被选择，并且每个突变都使用数字液滴 PCR 进行验证。为了证明该方案的误差校正表达水平，使用由 415 个已知与各种癌症相关的基因组成的定制基因面板来生成由每个基因最常见的表达外显子构建的文库。低丰度转录物的表达水平在重复之间具有高度可重复性。

然后使用数字液滴 PCR 验证具有不同表达的 6 个选定基因。比较表明，ECS 方案正确捕获了基因的表达水平，无需标准化。一旦你掌握了这项技术，这项技术就可以在一天半内轻松完成。

大部分时间将用于孵育，手动处理约占所需总时间的 30-40%，具体取决于研究人员同时处理的样品数量。在尝试此过程时，为同一样品提供重复测序文库非常重要。这将使您更有信心，如果突变本身在两个重复中都是独立的核心，则低频突变是真阳性。

按照此程序，可以执行其他事项，例如 ECS RNA，以回答诸如检测低丰度转录本或融合转录本等问题。经过开发，这项技术为主要在血液系统恶性肿瘤领域的研究人员铺平了道路，我们使用这项技术来探索健康个体中的白血病前克隆，以及检测处于缓解期的白血病患者的微小残留病。