野生型阻断PCR联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

本实验的总体目标是检测多种样本类型中的低频体细胞突变。该方法可通过提高对极低频突变的检出能力，帮助解决体细胞突变检测中的关键问题。在此，我们将检测骨髓样本中 myd88 基因的突变。

该技术的主要优势在于，即使肿瘤细胞数量极少，也能提供关于体细胞突变存在情况的高度准确且灵敏的信息。本检测基于一种野生型阻断PCR测序方法，旨在扩增 myd88 基因第5外显子的部分区域，确保覆盖L265热点突变位点。正向和反向引物在5'端设计有M13序列，以便兼容通用测序引物进行后续测序反应。

设计阻断寡核苷酸的长度约为10至15个碱基，并与需要进行突变富集的野生型模板互补。较短的寡核苷酸可提高错配 discrimination（区分能力）。为实现高靶标特异性，重要的是不要使用过多的阻断核苷酸，否则会导致寡核苷酸非特异性结合过强。

设计封闭寡核苷酸时，首先访问 Oligo Tools 网站。选择 Oligo TM 预测工具，新窗口将打开。

将要被阻断的野生型模板序列粘贴到引物序列框中。在阻断碱基前添加加号以标记它们。点击计算按钮，以确定DNA阻断杂交体的近似解链温度（TM）。

计算得到的熔解温度将显示在下方的框中。设计阻断寡核苷酸时，其熔解温度应比热循环过程中的延伸温度高10至15摄氏度。此处，延伸温度为72摄氏度。

为了调整熔解温度，可添加、删除或替换阻断碱基。避免出现三到四个连续的阻断型C或G碱基。接下来，为避免形成二级结构或自身二聚体，返回Oligo Tools网站主页，然后选择Oligo Optimizer工具。

新窗口将会打开。将需要被阻断的野生型模板序列粘贴到输入框中，并在需要阻断的位置添加加号以标记阻断碱基。

选择二级结构和“仅自身”这两个选项，然后点击分析按钮，以查看杂交和二级结构的得分。这些得分分别是对自身二聚体和二级结构熔解温度的粗略估计。得分越低越佳，可通过限制阻断剂与阻断剂之间的配对来实现较低得分。

通过移除或重新定位阻断核苷酸以获得更低的评分。此处所示针对 myd88 优化的阻断寡核苷酸在 DNA 阻断物杂交熔解温度与足够低的杂交及二级结构评分之间达到了平衡。该寡核苷酸设计用于覆盖氨基酸 Q262 至 I266 区域，并在 3' 端包含一个倒置的 DT，以抑制 DNA 聚合酶的延伸作用以及 3' 外切酶的降解作用。

引物设计完成后，按照随附文件中的说明设置野生型阻断 PCR 并进行热循环。将磁珠从 4 摄氏度的储存条件下取出，恢复至室温。转移 10 µL 的 PCR 产物至新的 PCR 板中。

剧烈涡旋磁珠，使磁性颗粒充分重悬，然后向新板的每个孔中加入18 µL磁珠。用移液器吹打10次以混匀。随后将板在室温下孵育5分钟。

孵育结束后，将PCR板置于侧边带裙边的磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。使用多通道移液器吸取上清液，注意避免触及磁珠沉淀。

接下来，向每个孔中加入150微升70%乙醇，在室温下孵育至少30秒。然后使用多通道移液器吸去乙醇并弃去枪头。重复此洗涤步骤一次。

使用20微升多通道移液器从每个孔中吸出残留的乙醇，并丢弃吸头。让板孔晾干约10分钟后，将其从磁铁上取下，然后向每孔中加入40微升无核酸酶水。上下吹打15次以充分混匀。

然后在室温下孵育两分钟。孵育结束后，将PCR板重新放回磁力架上静置一分钟，使磁珠与溶液分离。转移35微升纯化产物至新的PCR板中，并按照随附文件所述进行双向测序。

完成双向测序后，为纯化测序产物，需在 pH 5.2 的 25 倍稀释的 3 mol/L 醋酸钠溶液中加入 100% 乙醇，配制新鲜溶液。同时，配制新鲜的 70% 乙醇溶液。向正向和反向测序板的每个孔中加入 30 µL 醋酸钠与 100% 乙醇的混合液，上下吹打 5 次以充分混匀。

然后重新密封酶标板，在室温下避光孵育20分钟。20分钟后，以2,250 × g离心15分钟。离心结束后，移除板封膜，将酶标板在废液容器上方倒置一次。

如果多次倒置培养板，沉淀物可能会从孔底松脱。将倒置的培养板放置在一张干净的纸巾上，并以150 ×g离心1分钟。随后，向每个孔中加入150 µL 70%乙醇，并重新密封培养板。

在 2,250 × g 下离心 5 分钟。然后重复去除板封膜并倒置酶标板的操作。如果孔内未完全干燥，置于室温下空气干燥。

确保样品避光。待孔内完全干燥后，向每孔加入10微升甲酰胺，用移液器上下吹打10次以混匀。重新密封反应板。

使用热循环仪在95摄氏度变性3分钟，随后在4摄氏度保持5分钟。变性后，将板封膜更换为隔垫，按照制造商说明在测序平台上进行测序。使用序列分析软件查看测序峰图，并将序列与相应的参考序列进行比对。

将 myd88 与 NCBI 参考序列 NM002468 进行比对。来自突变与非突变患者的基因组 DNA 均经过常规 PCR 和野生型阻断 PCR 扩增，随后对所得 PCR 产物进行测序。如图所示，在实施野生型阻断 PCR 时，突变等位基因得到富集，而在野生型 DNA 中未观察到假阳性结果。

如图所示，当封闭剂浓度过高，或在双向测序前未能通过PCR后纯化步骤有效去除封闭剂时，常会出现信号强度显著下降的情况。这种情况通常发生在使用酶法纯化替代磁珠纯化时。任何基于PCR且富集突变等位基因的检测方法均可能检出低频人工假象。

这些痕迹表明，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中，当胞嘧啶或甲基化胞嘧啶分别通过福尔马林交联脱氨转化为尿嘧啶或硫代碱基时，CG位点的测序错误率相较于TA错误率有所增加。在野生型阻断PCR之前，尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）可切除尿嘧啶，从而有助于减少测序错误。然而，由5-甲基胞嘧啶脱氨生成的硫代碱基常出现在CpG岛区域，而UDG无法切除此类碱基。

降低野生型阻断 PCR 中所用阻断剂的浓度，可能有助于减少尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）处理无法消除的测序伪影。观看本视频后，您应能充分理解如何利用野生型阻断技术，以高准确度和高灵敏度检测体细胞突变。该技术的原理可应用于细胞小亚群中突变的检测。

因此，它可用于检测微小残留病灶、监测患者病情以及预测多种肿瘤患者的早期复发。