野生型阻断PCR联合直接测序作为一种高灵敏度检测低频体细胞突变的方法

本实验的总体目标是检测多种样本类型中的低频体细胞突变。该方法可通过提高极低频突变的检出能力，帮助解决体细胞突变检测中的关键问题。在此，我们将检测骨髓样本中 myd88 基因的突变。

该技术的主要优势在于，即使肿瘤细胞数量极少，也能提供关于体细胞突变存在的高度准确且灵敏的信息。该检测基于野生型阻断PCR测序方法，旨在扩增 myd88 基因第5外显子的部分区域，确保覆盖L265热点突变位点。正向和反向引物在5'端设计了M13序列，以便兼容通用测序引物进行后续测序反应。

设计阻断寡核苷酸，其长度约为10至15个碱基，并与希望实现突变富集的野生型模板互补。较短的寡核苷酸可提高错配 discrimination（区分能力）。为实现高靶标特异性，重要的是不要使用过多的阻断核苷酸，否则会导致寡核苷酸非特异性结合过强。

设计封闭寡核苷酸时，首先访问 Oligo Tools 网站。选择 Oligo TM 预测工具，新窗口将打开。

将要被阻断的野生型模板序列粘贴到引物序列框中。在阻断碱基前添加加号以标记它们。点击计算按钮，以确定DNA阻断物杂交体的近似熔解温度（TM）。

计算出的熔解温度将显示在下方的框中。设计阻断寡核苷酸时，其熔解温度应比热循环过程中的延伸温度高10至15摄氏度。此处的延伸温度为72摄氏度。

为了调节熔解温度，可添加、删除或替换阻断碱基。避免出现三到四个连续的阻断性C或G碱基。接下来，为避免形成二级结构或自身二聚体，请返回Oligo Tools网站主页，选择Oligo Optimizer工具。

新窗口将会打开。将要被阻断的野生型模板序列粘贴到输入框中，并添加加号以标记阻断的碱基。

选择二级结构和仅自身这两个选项，然后按下分析按钮，以查看杂交和二级结构的得分。这些得分分别是对自身二聚体和二级结构熔解温度的粗略估计。较低的得分为最佳，可通过限制阻断剂与阻断剂之间的配对来实现。

通过移除或重新定位阻断核苷酸以获得更低的评分。此处所示针对 myd88 优化的阻断寡核苷酸在 DNA 阻断物杂交熔解温度与足够低的杂交及二级结构评分之间实现了平衡。该寡核苷酸设计用于覆盖氨基酸 Q262 至 I266，并在 3' 端包含一个倒置的 DT，以抑制 DNA 聚合酶的延伸作用以及 3' 外切酶的降解作用。

引物设计完成后，按照随附文件所述设置野生型阻断PCR并进行热循环。将磁珠从4摄氏度保存条件下取出，恢复至室温。将10微升PCR产物转移至新的PCR板中。

剧烈涡旋磁珠，充分重悬磁性颗粒，然后向新板的每个孔中加入18 µL磁珠。用移液器吹打混合10次。随后将板在室温下孵育5分钟。

孵育结束后，将PCR板置于侧边带裙边的磁力架上静置2分钟，使磁珠与溶液分离。使用多通道移液器吸取上清液，注意避免触及磁珠沉淀。

接下来，向每个孔中加入 150 µL 70% 乙醇，并在室温下孵育至少 30 秒。然后使用多通道移液器吸去乙醇，并丢弃吸头。重复此洗涤步骤一次。

使用20微升多通道移液器从每个孔中吸取并移除残留的乙醇，并丢弃吸头。待板孔晾干约10分钟后，将板从磁铁上取下，向每孔中加入40微升无核酸酶的水。上下吹打15次以充分混匀。

然后在室温下孵育两分钟。孵育结束后，将PCR板放回磁力架上静置一分钟，使磁珠与溶液分离。将35 µL纯化产物转移至新的PCR板中，并按照随附文件所述方法进行双向测序。

完成双向测序后，为纯化测序产物，需在 pH 5.2 的 25 分之 1 体积的 3 摩尔醋酸钠溶液中加入 100% 乙醇，配制新鲜溶液。同时配制新鲜的 70% 乙醇溶液。向正向和反向测序板的每个孔中加入 30 微升醋酸钠与 100% 乙醇的混合液，并用移液器上下吹打五次以充分混匀。

然后重新密封酶标板，在室温避光条件下孵育20分钟。20分钟后，将酶标板在2,250 ×g条件下离心15分钟。离心结束后，移除板封膜，并将酶标板在废液容器上方倒置一次。

如果多次倒置培养板，可能会导致沉淀物从孔底松脱。将倒置的培养板放置在一张干净的纸巾上，以150 ×g 离心1分钟。随后，向每孔中加入150 µL 70%乙醇，并重新密封培养板。

在2,250 ×g下离心5分钟。然后重复去除板封膜并倒置培养板的操作。如果孔板未完全干燥，可在室温下静置晾干。

确保样品避光。待孔内完全干燥后，向每孔加入10 µL去离子甲酰胺，上下吹打10次以混匀。重新密封反应板。

使用热循环仪在 95 摄氏度变性 3 分钟，随后在 4 摄氏度保持 5 分钟。变性后，将板封膜更换为隔垫，然后根据制造商说明在测序平台上进行测序。使用序列分析软件查看测序峰图，并将序列比对至相应的参考序列。

将 myd88 与 NCBI 参考序列 NM002468 进行比对。来自有突变和无突变患者的基因组 DNA 均经过常规 PCR 和野生型阻断 PCR 扩增，随后对所得 PCR 产物进行测序。如图所示，在进行野生型阻断 PCR 时，突变等位基因得到富集，而在野生型 DNA 中未出现假阳性结果。

如果使用的阻断剂浓度过高，或在双向测序前未能通过PCR后纯化有效去除阻断剂，则常会出现如图所示的信号强度显著下降现象。当使用酶法纯化替代磁珠纯化时，便可能发生此类情况。任何基于PCR且富集突变等位基因的检测方法均会检出低频人工假象。

这些痕迹表明，在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中，胞嘧啶或甲基化胞嘧啶经福尔马林交联脱氨分别转化为尿嘧啶或硫胺时，CG位点的测序错误增加，相较于TA错误更为显著。在野生型阻断PCR之前，尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）可切除尿嘧啶，从而有助于减少测序错误。然而，由5-甲基胞嘧啶脱氨产生的硫胺（常见于CpG岛区域）无法被UDG切除。

降低野生型阻断 PCR 中所用阻断剂的浓度，可能有助于减少 UDG 处理无法消除的测序伪影。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用野生型阻断技术，以高准确度和高灵敏度检测体细胞突变。该技术的原理可应用于细胞小亚群中突变的检测。

因此，它可用于检测微小残留病灶、监测患者以及预测多种肿瘤患者的早期复发。