野生类型阻止PCR结合直接测序作为低频体细胞突变的检测的高灵敏度的方法

野生型封闭 PCR 后直接测序为多种样品类型中的低频体细胞突变提供了一种高灵敏度的检测方法。

该程序的总体目标是检测各种样本类型中的低频体细胞突变。这种方法可以通过促进极低频率突变的检测来帮助回答体细胞突变检测中的关键问题。在这里，我们将寻找骨髓样本中 myd88 基因的突变。

该技术的主要优点是它提供了有关体细胞突变存在的高度准确和敏感的信息，即使肿瘤细胞很少。这种基于野生型阻断 PCR 的测序检测旨在扩增 myd88 基因中外显子 5 的一部分，确保覆盖 L265 热点。正向和反向引物设计有 5 个引物 M13 序列，以允许互补测序引物的跪下。

将封闭寡核苷酸设计为大约 10 至 15 个碱基的长度，并在需要突变体富集的情况下与野生型模板互补。较短的寡核苷酸将改善错配鉴别。为了获得高靶标特异性，重要的是不要使用过多的封闭核苷酸，因为这会导致寡核苷酸非常粘稠。

要设计封闭寡核苷酸，请先导航到 Oligo Tools 网站。选择 Oligo TM 预测工具。将打开一个新窗口。

将要封闭的野生型模板的序列粘贴到寡核苷酸序列框中。在阻挡者基地前面添加一个加号来标记它们。单击计算按钮以确定 DNA 阻滞剂杂交体的近似 TM。

计算出的熔化温度将出现在下面的框中。在热循环过程中，将封闭寡核苷酸的熔解温度设计为比延伸温度高 10 至 15 摄氏度。在这里，延伸温度为 72 摄氏度。

要调整熔融温度，请添加、删除或替换封闭碱基。避免长时间的 3 到 4 个阻塞 C 或 G 碱基。接下来，为避免二级结构形成或自二聚化，请返回 Oligo Tools 网站主屏幕并选择 Oligo Optimizer 工具。

将打开一个新窗口。将要阻止的野生类型模板的序列粘贴到框中。添加加号以指示阻止基地。

选中 secondary structure 和 self only 两个框，然后按 analyze 按钮查看杂交和secondary structure的分数。这些分数分别代表了对自二聚体和二级结构的熔解温度的非常粗略的估计。较低的分数是最佳的，可以通过限制阻滞剂阻滞剂配对来实现。

去除或重新定位封闭核苷酸以获得较低的分数。此处显示的 myd88 优化封闭寡核苷酸在 DNA 阻断剂杂交熔解温度与足够低的杂交和二级结构评分之间取得了平衡。它旨在覆盖氨基酸 Q262 至 I266，并具有三个引物反向 DT，可抑制 DNA 聚合酶的延伸和三个引物核酸外切酶的降解。

设计引物后，设置野生型封闭 PCR 并按照随附文件所述进行热循环。从 4 摄氏度的储存中取出磁珠，并将其置于室温下。将 10 μL PCR 产物转移到新的 PCR 板中。

剧烈涡旋磁珠以完全重悬磁珠，然后向新板上的每个孔中加入 18 μL 磁珠。上下移液 10 次以混合。然后将板在室温下孵育 5 分钟。

孵育后，将 PCR 板放在侧裙边磁板上 2 分钟，以将磁珠与溶液分离。使用多通道移液器吸出上清液。注意避免珠子颗粒。

接下来，向每个孔中分配 150 微升 70% 乙醇，并在室温下孵育板至少 30 秒。然后用多通道移液器吸出乙醇并丢弃吸头。再次重复此洗涤程序。

使用 20 微升多通道移液器从每个孔中吸出剩余的乙醇并丢弃吸头。让板的孔干燥约 10 分钟后，将其从磁力架中取出，并向每个孔中加入 40 μL 无核酸酶的水。上下移液 15 次以混合。

然后在室温下孵育 2 分钟。孵育后，将 PCR 板放回磁板上 1 分钟，以将磁珠与溶液分离。将 35 μL 纯化产物转移到新的 PCR 板中，并按照随附文件中所述进行双向测序。

一旦进行了双向测序以纯化测序产物，在 PH 值为 5.2 和 100% 乙醇的情况下，制备了 3 摩尔乙酸钠的新鲜 25 溶液。还要准备 70% 乙醇的新鲜溶液。向正向和反向测序板的每个孔中加入 30 微升乙酸钠的 100% 乙醇溶液，并上下移液 5 次以混合。

然后重新密封板，并在室温下避光孵育 20 分钟。20 分钟后，将板以 2， 250 倍 G 离心 15 分钟。旋转后，取下板封口机，并在废液容器上倒置板一次。

如果板多次倒置，沉淀可能会从孔底松动。将倒置的板放在干净的纸巾上，以 150 倍 G 离心 1 分钟。接下来，向每个孔中加入 150 微升 70% 乙醇并重新密封板。

以 2、250 倍 G 的速度旋转 5 分钟。然后重复移除板封口机并倒置板的过程。如果孔没有完全干燥，请让它们在室温下风干。

确保样品避光。一旦孔完全干燥，向每个孔中加入 10 微升甲酰胺，并上下移液 10 次以混合。重新密封板。

使用热循环仪在 95 摄氏度下变性 3 分钟，然后在 4 摄氏度下变性 5 分钟。变性后，用隔垫替换板密封剂，并根据制造商的说明在测序平台上进行测序。使用序列分析软件，可视化轨迹，并将序列与适当的参考序列对齐。

将 myd88 与 NCBI 参考序列NM002468对齐。来自有突变和无突变患者的基因组 DNA 进行了常规和野生型阻断 PCR，然后对所得 PCR 产物进行测序。从这里可以看出，当进行野生型阻断 PCR 时，突变等位基因富集，在野生型 DNA 中未见假阳性。

如果使用过高浓度的阻断剂，或者如果 PCR 后纯化未能在双向测序前去除阻断剂，则通常会出现信号强度的特征性下降，如图所示。当进行酶纯化代替磁珠纯化时，会发生这种情况。任何富含突变等位基因的基于 PCR 的测定都会检测到低频伪影。

这些痕迹显示，当胞嘧啶或甲基化胞嘧啶分别通过正式固定到尿嘧啶或硫胺素上脱氨基时，相对于 FFPE 组织中的 TA 伪影，CG 测序伪影增加。尿嘧啶 DNA 糖基化酶或 UDG 可以在野生型封闭 PCR 之前切除尿嘧啶，有助于减少测序伪影。然而，由 CPG 岛经常出现的脱氨基 5 甲基胞嘧啶产生的硫胺素不能被 UDG 切除。

降低野生型封闭 PCR 中使用的阻断剂浓度可能有助于减少 UDG 处理无法修复的测序伪影的发生。看完这个视频后，您应该对如何使用野生型封闭技术以高度的准确性和灵敏度测试体细胞突变有了很好的了解。该技术的原理可应用于小亚群细胞的突变检测。

因此，它可用于检测微小残留病、监测患者和预测各种肿瘤患者的早期复发。