巢式 PCR 检测特异性病毒基因组序列

巢式聚合酶链式反应，巢式PCR可以选择性地扩增特定的基因序列。

要检测靶病毒序列，首先使用预混液，该预混液含有与在适当缓冲液中包含靶向病毒序列、dNTP 和耐热 DNA 聚合酶的较大 DNA 区域互补的外部引物。

从病毒感染细胞中提取的双链病毒DNA添加到该混合物中。将管子转移到热循环仪;运行第一个 PCR 循环。

变性过程中，双链 DNA 产生两个单链模板。在适当的退火温度下，外引物与其相应的靶序列结合。随后，DNA 聚合酶使用 dNTP 延伸引物，产生大扩增子，其中包含扩增 DNA 内的特定序列。

将这些扩增子转移到新管中。补充含有内侧或巢式引物的新鲜预混液，靶向较大扩增 DNA 中更小、更特异性序列的序列。运行第二次 PCR。

第二次 PCR 期间，DNA 链变性。变性后，巢状引物结合单链模板上的靶位点，然后聚合酶介导的引物延伸。

第二个 PCR 循环数次以专门扩增靶向病毒序列。

分析 PCR 产物以可视化较小的扩增子，确认特定病毒序列的存在。

取回必要的试剂并将它们保存在洁净室中的冰上，直到可以使用。准备好后，解冻并涡旋试剂。接下来，如文本方案表2所示，在1.5毫升离心管中为每个样品制备48微升第一轮PCR混合物，并将反应混合物分成0.2毫升PCR管。

在模板室的 PCR 工作站中，将 2 微升 cDNA 样品添加到第一轮 PCR 混合物中。包括两微升CVS-11 cDNA作为阳性对照和两微升双蒸馏水作为阴性对照。然后，将密封管转移到PCR热循环仪中，并使用文本协议表3中列出的参数进行循环。

首先，如文本方案的表4所示，在1.5毫升离心管中为每个样品制备48微升第二轮PCR混合物，并将反应混合物分成0.2毫升PCR管。将两微升第一轮 PCR 产物加入第二轮 PCR 混合物中。包括双蒸馏水作为本轮 PCR 的阴性对照。然后，使用文本方案表3中列出的参数进行PCR热循环。