微生物源使用特定的人类和动物病毒的追踪成本效益的方法
2011年12月3日
这项研究描述为粪/尿污染或使用人/猪/牛的DNA病毒，腺病毒和提出的MST工具多瘤病毒，具体量化的qPCR在水中的硝酸盐污染的来源识别成本效益的方法。
使用特定人类和动物病毒进行微生物来源追踪的经济高效的方法。该研究描述了一种经济高效的方法，用于鉴定粪便尿液污染源或水中硝酸盐污染的来源，使用定量 PCR 对人猪、牛、DNA 病毒、腺病毒和多瘤病毒进行特异性定量，建议作为微生物来源追踪工具。我们开发了一种方案，通过使用脱脂牛奶有机絮凝从 10 升水样中浓缩病毒，从沉积物中提取病毒核酸，并使用定量 PCR 定量人牛或猪 DNI 病毒。
众所周知，维生素的微生物污染对健康构成重大风险，我们需要了解污染的来源。我们提议使用高度普遍的 DNA 病毒作为微生物来源追踪工具。选定的病毒是腺病毒和多瘤病毒。
这些病毒全年在所有地理区域持续排泄。在以前的研究中研究过。我们已经为水中病毒开发了稳定、低成本的浓缩方法，并且我们一直在努力开发用于定量嘌呤腺病毒和牛多瘤病毒的 QPCR 检测方法。
此外，我们使用经 QPCR 测试的人腺病毒、NGC 多瘤病毒，也作为水中人类污染的标志物，收集水样。在本研究中，在平底塑料容器中收集 4 个重复样品，每个水样 10 升，并额外收集 1 个样品作为过程对照。最后一个样品将接种已知量的病毒颗粒作为对照。
在实验室中，通过使用在一个额外的 10 升塑料容器中的条件下的自来水制备阴性对照。如果样品中存在大量悬浮物、沙子和其他物质，请让它沉淀 15 分钟，然后将水转移到新的容器中。通过有机絮凝进行病毒浓缩。
在低污染或中度污染的水样中检测病毒需要将至少几升水中的病毒浓缩成更小的体积。浓缩程序包括对 10 升水样进行酸化，使用脱脂牛奶重力絮凝，使鸡群沉淀并将沉淀物收集在 10 毫升磷酸盐缓冲液中以开始该过程，通过将 10 克脱脂奶粉溶解在一升人工海水中并小心地将 pH 值调节至 3.5 来制备将脱脂牛奶定位在人工海水中的溶液。使用盐酸时，羊群应该是可见的。
在使用前准备溶液或在 4 摄氏度下储存 24 小时。搅拌水样并测量样品中的电导率。如果低于 1.5 毫西门子，则添加海盐。
通过添加盐酸将水样的 pH 值调节至 3.5。记录活化前后样品的 pH 值，以及所用盐酸的体积。还应记录电导率。
调节 pH 值后，我们将 100 毫升 pref flod 脱脂牛奶（1%）添加到 10 升水样中，并搅拌样品 8 至 10 小时，让病毒吸收到羊群中。对于用作过程对照的加标样品，向样品中加入标准体积的对照病毒，例如 1 mL。停止搅拌，让鸡群在重力作用下沉淀 8 到 10 小时。
16 小时后，通常是第二天，我们将能够收集沉积物。为此，请使用蠕动泵去除上清液。将沉淀物与鸡群一起收集，大约 500 毫升放入离心瓶中。
通过添加 pH 值为 3.5 的 pref flod 脱脂牛奶来平衡罐子，用高速离心机离心罐，8， 000 Gs 在 4 摄氏度下 30 分钟。离心机停止后，小心地从离心机上取出离心罐。非常轻柔地倒出并丢弃上清液。
将沉淀溶解在每个离心瓶中，至最终体积为 10 mL磷酸盐，进行核酸提取和病毒定量。病毒浓缩物用于提取病毒核酸，感兴趣的特异性腺病毒和多瘤病毒将通过 A-Q-P-C-R 进行定量。使用 Key amp 病毒 RNA 小量提取试剂盒进行核酸提取。
存在于 140 中的病毒裂解。手动进行微升病毒浓缩物，并将总核酸提取至 80 微升。此工具包支持使用自动化平台，例如 Key Cube。
下一步是病毒基因组的定量。使用带有 tac man 探针的定量 PCR 样品中的副本、人腺病毒、JC 多瘤病毒和牛多瘤病毒可以在同一 96 孔板中定量。由于所有病毒都使用相同的扩增循环，因此应在独立的板中单独检测猪腺病毒，以定量目标病毒。
在干净的单独区域制备定量 PCR 混合物。制备混合物后，向每个孔中分配 15 μL，包括对照。将样品中提取的核酸提取物加入 10 微升，在一个单独的区域内直接运行，并在每个样品的纯水中稀释 10 倍，一式两份，添加靶标后一次反应的总体积为 25 微升，15 份混合物加 10 份样品或标准品，用粘合剂盖的一部分覆盖含有样品的孔。
保留盖子的另一部分以用于以下步骤。DNA 标准悬液的 AB 稀释液。从 10 到 0 到 10 到 6 个基因组拷贝的 10 微升，一式三份假装微升，并使用专门用于标准 DNA 覆盖的微 pbit。
包含标准品的孔，上面有先前切割的粘合剂盖。此图显示了标准悬浮液样品和对照的分布。在 96 孔板中。
在适当的系统中执行 QPCR，在激活振幅金 10 分钟后选择合适的参数。在 95 摄氏度下，反应完成后进行 40 个扩增循环。按照所用设备的用户手册中的说明存储数据和结果。
DNA 的量将被定义为在需要时校正稀释因子后获得的数据的中位数。用于定量猪腺病毒的扩增曲线和标准曲线显示相关系数为 0.999。按照该过程，可接受的斜率值范围为负 3.1 和负 3.6。
所述人类和动物病毒已在硝酸盐含量高地区的地下水样本中进行了测试，以确定污染源。分析的四个重复显示猪腺病毒平均值为阳性结果，每 10 个基因组拷贝 7.74 个到每升 2 个基因组拷贝，这与采样点周围区域存在猪粪浆有关，并将证明地下水中存在猪粪污染。所有测试样本均未存在人类污染。
病毒学数据通过巢式 PCR 和测序分析进行确认。结论。在这项研究中，我们展示了地下水样本的分析结果，在没有人类或牛污染的情况下呈现了猪源性污染。该程序还已应用于沐浴水、海水和河水的分析。
我们在这里介绍了应用这些工具识别地下水中污染源的程序，以高水平的硝酸盐为例，说明所开发方法可用于检测环境中的污染源。
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概览
本研究提出了一种识别水中粪便和尿液污染源的成本效益法。利用定量PCR，该方法定量分析特定的人类、猪类和牛类DNA病毒，包括腺病毒和多瘤病毒，作为微生物源追踪的工具。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物源追踪
- 环境微生物学
- 水质评估
背景
- 微生物污染带来重大健康风险。
- 识别污染源对公共健康至关重要。
- DNA病毒普遍存在，可以作为有效的追踪工具。
- 腺病毒和多瘤病毒被选用因为它们的相关性。
研究目的
- 开发一种追踪水中粪便污染的方法。
- 量化水样中的特定DNA病毒。
- 加深对污染源的理解。
使用的方法
- 从10升水样中浓缩病毒。
- 使用脱脂奶进行有机絮凝以提取病毒核酸。
- 通过定量PCR定量人类、猪类和牛类DNA病毒。
- 通过选定的病毒指标评估污染源。
主要结果
- 成功浓缩和定量目标病毒。
- 证明该方法在微生物源追踪方面的有效性。
- 确定腺病毒和多瘤病毒为可靠的指标。
- 为水污染评估提供了一种成本效益的解决方案。
结论
- 开发的方法对于识别污染源是有效的。
- 利用DNA病毒可以增强微生物源追踪的效果。
- 这种方法可以显著改善水质监测。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying contamination sources in water is critical for public health risk assessment and environmental monitoring. This method provides a cost-effective, high-throughput approach to microbial source tracking using species-specific DNA viruses as reliable indicators. It supports predictive confidence in contamination source attribution and enables scalable screening across diverse water matrices.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of fecal contamination hypotheses through quantification of human adenoviruses, JC polyomaviruses, porcine adenoviruses, and bovine polyomaviruses as specific biomarkers.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible protocol for viral concentration from 10-liter water samples using skimmed milk flocculation and gravity sedimentation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral genome copy data via qPCR with TaqMan probes, enabling sensitive detection down to 1-10 genome copies per test tube for porcine and bovine markers.
- Operational Value: Facilitates high-throughput processing of multiple samples in parallel using 96-well plate formats and automated nucleic acid extraction platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking viral markers to contamination sources such as porcine slurries in groundwater, as demonstrated in nitrate-impacted samples.
- Operational Value: Ensures translational continuity from environmental sampling to molecular quantification, with nested PCR and sequencing used for virological data confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into environmental microbiology workflows from sample concentration through nucleic acid extraction to quantitative viral measurement, enabling source attribution in water quality assessment pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding contamination origins by quantifying virus-specific biomarkers associated with human, porcine, or bovine fecal sources.
- Screening: Delivers assay readiness through a one-step concentration protocol that eliminates bottlenecks of traditional two-step methods, allowing simultaneous processing of large sample sets.
- Analytics: Provides quantitative outputs via qPCR standard curves and amplification plots, with acceptable slope values between -3.1 and -3.6 and correlation coefficients of 0.999 for porcine adenovirus quantification.
- Translational Research: Connects environmental detection to source identification through correlation of viral markers with known contamination sources, such as porcine slurry in high-nitrate groundwater.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, low-cost capability for viral concentration and quantification applicable to bathing waters, seawater, river water, and groundwater across diverse geographical areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in source tracking by using persistent, geographically widespread DNA viruses excreted in feces and/or urine.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility through a one-step protocol involving acidification, skimmed milk flocculation, gravity sedimentation, and centrifugation at 8,000 × g for 30 minutes at 4°C.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in environmental monitoring by providing cost-effective, high-sensitivity detection of contamination sources without requiring expensive infrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of remediation efforts by distinguishing between human, porcine, and bovine contamination sources in water samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in environmental virology, nucleic acid extraction, and quantitative PCR assay design and execution.
- Needs access to centrifugation equipment capable of 8,000 × g, nucleic acid extraction kits (e.g., Key Amp Viral RNA Mini Kit), and qPCR systems with TaqMan probe compatibility.
- Demands standardization of pH adjustment to 3.5 using hydrochloric acid, skimmed milk flocculation (1% v/v), and gravity sedimentation timing (8–10 hours) across teams and sites.
- Involves adaptation considerations for varying water matrices, including pre-sedimentation for high-turbidity samples and conductivity adjustment with sea salts when below 1.5 mS/cm.
- Includes practical limitations such as the need for separate qPCR plates for porcine adenoviruses due to potential probe compatibility issues, even when using similar amplification cycles.
