一种利用特异性人源和动物源病毒进行微生物源追踪的经济高效方法

利用特异性人源和动物源病毒进行微生物溯源的低成本方法。本研究描述了一种利用定量PCR对作为微生物溯源工具提出的人腺病毒、多瘤病毒及人源、猪源、牛源DNA病毒进行特异性定量，从而鉴定水体中粪便污染或硝酸盐污染来源的低成本方法。我们已建立一种从10升水样中浓缩病毒的方案，该方法采用有机絮凝法，通过脱脂牛奶从沉淀物中提取病毒核酸，并利用定量PCR对人源、牛源或猪源DNA病毒进行定量。

众所周知，维生素的微生物污染构成重大的健康风险，因此我们需要了解污染的来源。我们提出利用高流行率的DNA病毒作为微生物溯源的追踪工具。所选择的病毒为腺病毒和多瘤病毒。

这些病毒全年在所有地理区域持续排出。此前已有相关研究。我们已开发出针对水中病毒的高效低成本浓缩方法，并一直致力于开发用于定量检测禽腺病毒和牛多瘤病毒的QPCR检测方法。

此外，我们还使用人腺病毒和NGC多瘤病毒（通过QPCR检测）作为水中人类污染的指示标志物。水样的采集方法如下：在本研究中，每个水样采集四个10升的重复样本，盛装于平底塑料容器中，并额外采集一个样本作为过程对照。最后一个样本将接种已知数量的病毒颗粒作为对照。

通过在一个额外的10升塑料容器中使用条件化自来水，在实验室中制备阴性对照。如果样品中含有大量悬浮物质、沙子及其他材料，静置15分钟使其沉淀，然后将上清液转移至新容器中。采用有机絮凝法进行病毒浓缩。

在低或中等污染程度的水样中检测病毒，需要将至少数升水中的病毒浓缩至更小的体积。浓缩过程包括：将10升水样酸化，使用脱脂牛奶进行絮凝，重力沉降絮状物，并将沉淀物收集于10毫升磷酸盐缓冲液中以启动后续流程。制备人工海水中脱脂牛奶定位溶液时，需将10克脱脂奶粉溶于1升人工海水中，并用盐酸小心调节pH至3.5，此时应可见絮状物形成。

在使用前立即配制该溶液，或在4°C下保存24小时。水样需搅拌并测定其电导率。若电导率低于1.5毫西门子，则需添加海水盐。

通过加入盐酸将水样的 pH 值调节至 3.5。记录样品在调节前后的 pH 值，以及所用盐酸的体积。同时应记录电导率。

调节pH后，向10升水样中加入100毫升预过滤的脱脂乳（1%），搅拌样品8至10小时，使病毒吸附到絮状物上。对于用作过程对照的加标样品，向样品中加入标准量的对照病毒（例如1毫升）。停止搅拌，静置8至10小时，使絮状物通过重力沉降。

16 小时后，通常为次日，即可收集沉淀物。操作时，使用蠕动泵移除上清液。将含有絮状物的沉淀物收集起来，约 500 毫升，置于离心管中。

通过添加预调pH为3.5的脱脂牛奶平衡容器，使用高速离心机在4°C下以8,000 ×g离心30分钟。离心停止后，立即小心地从离心机中取出离心罐。非常轻柔地倾倒并弃去上清液。

将每个离心管中的沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液中，定容至终体积为10毫升，用于病毒的核酸提取与定量。病毒浓缩液用于提取病毒核酸，并通过A-Q-P-C-R方法对目标腺病毒和多瘤病毒进行定量。使用Key Amp病毒RNA小型试剂盒进行核酸提取。

对140 µL病毒浓缩液中的病毒进行手动裂解，并将总核酸提取至80 µL。该试剂盒支持使用Key cube等自动化平台。

下一步是病毒基因组的定量。可通过使用TaqMan探针的定量PCR，在同一块96孔板中对样品中的病毒拷贝数进行定量，包括人腺病毒、JC多瘤病毒和牛多瘤病毒。由于所有病毒均采用相同的扩增循环数，猪腺病毒应单独使用另一块96孔板进行目标病毒的定量检测。

在洁净的独立区域中配制定量 PCR 反应液。反应液配制完成后，将 15 微升分配至每个孔中，包括对照孔。在另一个独立区域中，向各孔加入 10 微升样品的核酸提取物，每个样品需同时进行直接加样和在纯化水中进行十倍稀释，均设复孔；加入模板后每孔总反应体积为 25 微升（15 微升反应液 + 10 微升样品或标准品），然后用粘性封板膜覆盖含有样品的孔。

将盖子的另一部分保留用于下一步操作。对DNA标准品悬浮液进行AB稀释：从10⁰到10⁶基因组拷贝数，每个浓度取10微升，设三个重复，使用专用于标准品DNA的微量移液器操作。

含有标准品的孔板已预先贴上粘性覆盖膜并进行切割。该图显示了标准品悬浮液样本和对照样本在96孔板中的分布情况。

在激活Amplitude Gold 10分钟后，选择适当参数，在合适的系统中进行qPCR。当反应完成后，在95摄氏度下进行40个扩增循环。按照所用设备的用户手册中所述方式存储数据和结果。

DNA 的量将定义为在需要时校正稀释倍数后所得数据的中位数。猪腺病毒定量所获得的扩增曲线和标准曲线显示相关系数为 0.999。按照该操作步骤，可接受的斜率值范围为 -3.1 至 -3.6。

已针对硝酸盐含量较高的区域的地下水样本，检测了已知的人类和动物病毒，以确定污染来源。所分析的四份重复样本均检出猪腺病毒阳性，平均值为每升7.74 × 10²个基因组拷贝，该结果与采样点周边区域存在猪粪浆有关，证明地下水中存在猪源粪便污染。在所有检测样本中均未发现人类污染。

病毒学数据通过巢式PCR和测序分析得到证实。结论：本研究报道了对地下水样本的分析结果，显示存在猪源性污染，而无人类或牛源性污染。该方法还已应用于浴场水、海水和河水的分析。

本文介绍了将这些工具应用于地下水污染源识别的方法，以硝酸盐含量较高为例，说明所开发方法在检测环境中污染源的适用性。