Name: 微生物源使用特定的人类和动物病毒的追踪成本效益的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 了解利用定量PCR技术检测水中特定人类、猪和牛DNA病毒的成本效益型微生物溯源方法。该方法通过有机絮凝浓缩病毒，为水质评估提供可靠的污染源追踪工具。

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本研究工作部分得到了西班牙政府“教育与科学部”（项目编号：AGL2008-05275-C01/ALI）、欧盟第七研究框架计划资助项目VIROBATHE（合同号：513648）、VIROCLIME（合同号：243923）以及加泰罗尼亚水务局（Agència Catalana de l'Aigua，ACA）水生生态系统监测与改善部门的资助。在本研究开展期间，Marta Rusiñol 获得了加泰罗尼亚政府“AGAUR”项目的资助（FI-DGR）。

1. 水样中病毒颗粒的浓缩
<ol>
	<li>水样的采集与预处理
		<ol>
		<li>使用平底塑料容器，每份样品至少采集2个10 L的重复样本，并额外采集一份作为过程对照。该对照样本将加入已知数量的病毒颗粒，用作控制。 
		注意：建议为加标样本准备专用的独立材料（如瓶子、试管等）。</li>
		<li>检查电导率仪的校准情况，必要时重新校准。另取一个10 L塑料容器，用经调节至适当电导率的自来水（见下文1.6）制备阴性对照。</li>
		<li>对于加标样本：加入标准体积的对照病毒（约每10 L水中含105个基因拷贝）。通过搅拌混合，避免飞溅和气溶胶产生。阳性对照可选用非常见的腺病毒株，如HAdV-35，或噬菌体如MS2。</li>
		<li>若样品中含有大量悬浮物（如沙粒或其他物质），静置15分钟使其沉降，然后将上清液转移至新容器中。</li>
		<li>通过加入1 N HCl将水样pH调节至3.5（±0.1）。此步骤对病毒浓缩至关重要，需确保pH已准确调节。在加入HCl时剧烈搅拌，充分混匀。（注意：若pH低于3.5，则加入1 M NaOH进行调节）。</li>
		<li>调节电导率。若样品电导率≥1500 μS/cm，则无需此步骤；若电导率低于1500 μS/cm，则无法保证形成絮状沉淀（flocs），因此需通过加入人工海盐（Sigma）将电导率调节至1500 μS/cm。在加入海盐时剧烈搅拌以充分混合。</li>
		<li>记录样品在预处理前后pH值以及所用HCl体积。调节pH后也应记录电导率。每次使用后，必须用新鲜HCl溶液对pH计和电导率仪电极进行消毒，再用10%硫代硫酸钠溶液脱氯，最后用蒸馏水冲洗。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>预絮凝脱脂牛奶（PSM）溶液的制备（1%）
		<ol>
			<li>检查pH计和电导率仪的校准情况，必要时重新校准。</li>
			<li>通过将10 g脱脂奶粉（Difco）溶于1 L人工海水（将33.3 g人工海盐溶于1 L脱氯自来水，高压灭菌）中，配制1%（w/v）预絮凝脱脂牛奶（PSM）溶液，并用1 N HCl小心调节pH至3.5。此时应可见絮状物形成。该溶液应在使用前新鲜配制，或在4°C下保存不超过24小时。脱氯处理方法为：每100 ml水样中加入1 ml 10%硫代硫酸钠溶液。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>水样中病毒颗粒的絮凝
		<ol>
		<li>向10 L水样中加入100 ml 1% PSM溶液。</li>
		<li>搅拌8–10小时，使病毒充分吸附至絮状物上。使用定时器，在8–10小时后自动停止搅拌。</li>
		<li>停止搅拌，静置8–10小时，使絮状物通过重力自然沉降。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>收集并重新溶解絮状物。离心
		<ol>
		<li>使用蠕动泵和连接塑料管的塑料移液管移除上清液。对于加标样本，上清液应收集至容器中，并按照内部规程进行消毒处理。所有情况下均需注意：切勿收集沉淀物。</li>
		<li>将含有絮状物的沉淀（约500 ml）收集至离心管中。</li>
		<li>通过加入pH 3.5的PSM溶液平衡离心管重量。</li>
		<li>在高速离心机中以8,000 × g、4°C离心30分钟。离心结束后立即小心取出离心管。</li>
		<li>非常轻柔地倾倒并弃去上清液。处理具有感染性的材料时应采取适当防护措施。</li>
		<li>向每个离心管中加入7 ml磷酸盐缓冲液，以溶解沉淀物。</li>
		<li>待絮状物完全溶解后，测量体积，并补加磷酸盐缓冲液至总体积为10 ml。</li>
		<li>通过涡旋振荡混匀病毒浓缩液，将10 ml溶液分装至洁净的微量离心管中，于-80°C冷冻保存，待后续分析时使用。</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
2. 核酸提取
<ol>
	<li>按照制造商说明，使用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 进行核酸提取。该试剂盒可配合自动化平台（如 Qiacube, Qiagen）使用。</li>
</ol>
3. 人腺病毒（HAdV）、JC 多瘤病毒（JCPyV）、猪腺病毒（PAdV）和牛多瘤病毒（BPyV）的定量 PCR
<ol>
	<li>样品中基因组拷贝数的定量
		<ol>
		<li>在洁净的独立区域中，使用 TaqMan Environmental PCR Master Mix 2x（Applied Biosystems）配制 qPCR 反应体系。反应在96孔光学反应板中进行，并用光学粘性封板膜覆盖。Master Mix、引物和探针的浓度详见表1。</li>
		<li>配制好反应混合液后，将15μl分装至各孔中（包括对照孔，见3.2）。加入目标样本后，单个反应的总体积为25μl（15μl混合液 + 10μl样本或标准品）。</li>
		<li>在另一个独立区域中，加入各样本的核酸提取物（10μl）。每个样本需进行直接检测以及在纯化水中进行10倍稀释，并设两个重复。用粘性封板膜的一部分覆盖含样本的孔，保留另一部分用于后续步骤。</li>
		<li>使用专用于标准DNA的移液器，以三重复方式加入从100到106 GC/10μl的DNA标准品稀释液（10μl）。建议在配备紫外线照射装置的区域中操作标准品，以降解可能残留的质粒DNA，并在每次使用后清洁移液器。用预先裁剪好的粘性封板膜覆盖含标准品的孔。 
		注：为制备用于基因组拷贝数定量的标准品，应将目标DNA片段克隆至质粒中并进行线性化处理。以下网址提供有关如何使用质粒DNA模板构建qPCR标准曲线的详细操作流程： 
		<a href="http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf">http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/quant_pcr.pdf</a></li>
		<li>在合适的qPCR系统中运行反应，并选择适当的参数（考虑使用粘性封板膜及每孔总体积等因素）。首先在95°C下激活AmpliTaq Gold 10分钟，随后进行40个循环的扩增：对于HAdV、JCPyV和BPyV，条件为95°C 15秒和60°C 1分钟；对于PAdV，条件为95°C 15秒、55°C 20秒和60°C 20秒。</li>
		<li>反应完成后，按照所用设备的用户手册说明存储数据和结果。DNA含量将根据校正稀释倍数后的数据中位数确定。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>对照设置
		<ol>
		<li>需使用阳性和阴性对照。检测必须包含多个无模板对照（NTC），以验证反应体系本身不产生荧光信号。建议同时运行阳性过程对照，以评估研究样本中可能存在的抑制物对酶活性的潜在抑制作用。</li>
		<li>记录标准DNA两个不同稀释度以及过程对照的qPCR检测结果。利用这些结果建立控制图，用于与检测灵敏度和效率相关的质量控制（QC）程序。</li>
		</ol>
	</li>
	<li>结果确认
		<ol>
		<li>阳性结果可通过巢式PCR及扩增子的核苷酸测序进一步验证，从而获得所检测毒株的更多核苷酸序列信息1,5,6,7,9,12。</li>
		</ol>
	</li>
</ol> 
根据所述方法，已在浴场水、海水和河水样本中检测并定量了人和动物病毒2,3。作为代表性示例，研究人员对硝酸盐含量较高的区域的地下水样本进行了分析，以确定污染来源。从西班牙东北部农村地区的4口水井中各采集10升水样，每口井采集5个重复样本，其中1个重复样本接种人腺病毒2型，作为过程对照。样本按照图1所示的方案进行处理。在4个采样点之一的4个重复样本中，猪腺病毒（PAdV）检测结果呈阳性（平均值为7.74×102 GC/L），表明采样点周边存在猪粪浆，支持猪粪污染是地下水中硝酸盐来源的推断（表2）。
4. 代表性结果：
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820fig1.jpg" alt="水样分析流程图；病毒浓缩、核酸提取、qPCR。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. 水中病毒检测与定量的操作流程。
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820table1.jpg" alt="PCR实验分析中用于引物工作液的体积与浓度的引物工作液表。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表 1"> 
表 1. qPCR检测中引物和探针的浓度。
<img src="/files/ftp_upload/2820/2820table3.jpg" alt="通过qPCR进行病毒定量；表格比较了人和动物病毒数据与理化参数。" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表3"> 
表2. 地下水样品中动物和人类腺病毒及多瘤病毒的检测与定量。 
n 分析的重复次数 
% 阳性重复样本的百分比 
(-) 未检出

<ol><li>Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Major, E. O., Curfman, B., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+excreted+JC+virus+strains+and+their+potential+oral+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the excreted JC virus strains and their potential oral transmission.</a> J. Neurovirol. 9 (4), 498-507 (2003).</li>
<li>Bofill-Mas, S., Albinana-Gimenez, N., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Rodriguez-Manzano, J., Allard, A., Calvo, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+stability+of+human+adenoviruses+and+polyomavirus+JCPyV+in+wastewater+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification and stability of human adenoviruses and polyomavirus JCPyV in wastewater matrices.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7894-7896 (2006).</li>
<li>Calgua, B., Mengewein, A., Grunert, A., Bofill-Mas, S., Clemente-Casares, P., Hundesa, A., Wyn-Jones, A. P., López-Pila, J. M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> J. Virol. Methods. 153 (2), 79-83 (2008).</li>
<li>Hernroth, B. E., Conden-Hansson, A. C., Rehnstam-Holm, A. S., Girones, R., Allard, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+factors+influencing+human+viral+pathogens+and+their+potential+indicator+organisms+in+the+blue+mussel%2C+Mytilus+edulis%3A+the+first+Scandinavian+report%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental factors influencing human viral pathogens and their potential indicator organisms in the blue mussel, Mytilus edulis: the first Scandinavian report.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 4523-4533 (2002).</li>
<li>Hundesa, A., Bofill-Mas, S., de Motes, M. aluquer, Rodriguez-Manzano, C., Bach, J., Casas, A., M,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+PCR+assay+for+the+quantitation+of+bovine+polyomavirus+as+a+microbial+source-tracking+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative PCR assay for the quantitation of bovine polyomavirus as a microbial source-tracking tool.</a> J. Virol. Methods. 163 (2), 385-389 (2010).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Albinana-Gimenez, C., Rodriguez-Manzano, N., Bofill-Mas, J., Suñen, S., E,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+qPCR+assay+for+the+quantification+of+porcine+adenoviruses+as+an+MST+tool+for+swine+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a qPCR assay for the quantification of porcine adenoviruses as an MST tool for swine fecal contamination in the environment.</a> J. Virol. Methods. 158 (1-2), 130-135 (2009).</li>
<li>Hundesa, A., de Motes, M. aluquer, Bofill-Mas, C., Albinana-Gimenez, S., N,, Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+and+animal+adenoviruses+and+polyomaviruses+for+determination+of+sources+of+fecal+contamination+in+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of human and animal adenoviruses and polyomaviruses for determination of sources of fecal contamination in the environment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72 (12), 7886-7893 (2006).</li>
<li>Layton, B. A., Walters, S. P., Lam, L. H., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterococcus+species+distribution+among+human+and+animal+hosts+using+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enterococcus species distribution among human and animal hosts using multiplex PCR.</a> J. Appl. Microbiol. 109, 539-547 (2010).</li>
<li>de Motes, M. aluquer, Clemente-Casares, C., Hundesa, P., Martín, M., Girones, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+bovine+and+porcine+adenoviruses+for+tracing+the+source+of+fecal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Detection of bovine and porcine adenoviruses for tracing the source of fecal contamination.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70 (3), 1448-1454 (2004).</li>
<li>Pal, A., Sirota, L., Maudru, T., Peden, K., Lewis, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+assays+for+the+detection+of+virus-specific+DNA+in+simples+with+mixed+populations+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR assays for the detection of virus-specific DNA in simples with mixed populations of polyomaviruses.</a> J. Virol. Methods. 135 (1), 32-42 (2006).</li>
<li>Stapleton, C. M., Kay, D., Wyer, D. avies, Watkins, C., Kay, J., McDonald, C., Porter, A. T., J,, Gawler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+operational+utility+of+a+Bacteroidales+quantitative+PCR-based+MST+approach+in+determining+the+source+of+faecal+indicator+organisms+at+a+UK+bathing+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluating the operational utility of a Bacteroidales quantitative PCR-based MST approach in determining the source of faecal indicator organisms at a UK bathing water.</a> Water Res. 43, 4888-4899 (2010).</li>
<li>Wang, J., Horner, G. W., Keef, O., S, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+molecular+characterization+of+bovine+polyomavirus+in+bovine+sera+in+New+Zealand%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Z.+Vet.+J%22%5BJournal%5D)">Detection and molecular characterization of bovine polyomavirus in bovine sera in New Zealand.</a> N. Z. Vet. J. 53, 26-30 (2005).</li>
</ol>

2009年提交了两项专利申请，以保护PAdV和BPyV定量检测方案的知识产权。

所述方法可满足常规环境与公共卫生实验室所要求的适用条件：可重复、可靠、简便且经济有效。该方案虽简单，但必须严格遵循操作步骤。若样品中未添加规定浓度的人工海水盐，则电导率过低，会导致病毒回收率显著降低；同样，若絮凝过程的搅拌时间明显缩短（例如少于5小时），病毒回收率也会大幅下降。
目前应用的微生物源追踪（MST）工具通常基于分子技术。不同研究团队开展的研究表明，在当前使用的各种参数（即细菌基因）中，没有任何单一参数具有足够的特异性。因此，建议采用多种参数组合的方式，作为有效追踪水体中粪便污染来源的最佳策略8,11。
近年来，针对某些在多数情况下不引起临床症状却可导致持续性感染的特定DNA病毒的研究，已成为一种用于追踪环境中粪便污染来源的方法。定量PCR技术及所提出的浓缩方法可提供这些病毒浓度的可靠数值，为风险评估研究和修复措施的制定提供极为宝贵的数据。这些技术还具有高度的灵敏性和特异性，这对于追踪污染源至关重要。此外，这些方法还将成为生成更大数据库的有力工具，用于对作为微生物源追踪工具的特定病毒在不同地理区...

<table><tbody><tr><td>高速离心机（8,000×g）</td><td>Berckman Coulter</td><td>Avanti J-20XP</td><td></td></tr><tr><td>pH计、温度计和电导率仪</td><td>Afora</td><td>LPPC3003</td><td></td></tr><tr><td>长度为100-200 cm的塑料管</td><td>Deltalab</td><td>350059</td><td></td></tr><tr><td>无菌刻度一次性移液管</td><td>Labclinics</td><td>PN10E1</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 和 10-15 mL 的无菌塑料管（Eppendorf、Falcon等）</td><td>Afora</td><td>KA298/00</td><td></td></tr><tr><td>离心瓶（500 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SE5753512</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器和搅拌子（每个样品一个）</td><td>Fisher Scientific</td><td>10510</td><td></td></tr><tr><td>平底玻璃或塑料容器，可用于磁力搅拌</td><td>Deltalab</td><td>191642</td><td></td></tr><tr><td>用于去除上清液的蠕动泵（或水射流真空泵）</td><td>Watson-Marlow Pumps Group</td><td>323E/D</td><td></td></tr><tr><td>定时器，用于在搅拌8-10小时后关闭设备</td><td>Deltalab</td><td>900400</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（1N 和 0.1N）</td><td>Panreac</td><td>141020.1611</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（1N）</td><td>Panreac</td><td>131687.1211</td><td></td></tr><tr><td>人工海水盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9883</td><td></td></tr><tr><td>脱脂牛奶（SM）</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 pH 7.5</td><td></td><td></td><td>将无菌的0.2 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 与 0.2 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 按1:2体积比混合，调节pH至7.5</td></tr><tr><td>硫代硫酸盐</td><td>Panreac</td><td>121879.1209</td><td>配制成10%的水溶液</td></tr><tr><td>QIAamp 病毒RNA小型试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>52904</td><td></td></tr><tr><td>96孔光学反应板（500个单位）</td><td>Applied Biosystems</td><td>43426659</td><td></td></tr><tr><td>光学粘性封板膜（100个单位）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan 环境PCR预混液 2×</td><td>Applied Biosystems</td><td>4396838</td><td></td></tr></tbody></table>

一种利用特异性人源和动物源病毒进行微生物源追踪的经济高效方法

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

环境中微生物污染构成重大的健康风险。传统的细菌性粪便指示物已被证明存在显著局限性，而病毒对许多灭活过程更具抗性，且标准粪便指示物无法提供污染来源的信息。开发经济高效的病毒浓缩方法以及分子检测技术，有助于将病毒作为粪便污染指示物和微生物源追踪（MST）工具加以应用。腺病毒和多瘤病毒是感染包括人类在内的特定脊椎动物的DNA病毒，在所有已研究的地理区域中，均能在粪便和/或尿液中持续排出。在先前的研究中，我们提出通过定量PCR（qPCR）对人腺病毒（HAdV）和JC多瘤病毒（JCPyV）进行定量，作为人类粪便污染的指标。近期，我们已开发出用于特异性定量猪腺病毒（PAdV）和牛多瘤病毒（BPyV）的qPCR检测方法，作为动物粪便污染标志物，其检测灵敏度可达每反应管1-10个基因组拷贝。在本研究中，我们介绍了利用这些工具识别水样中污染来源的操作流程。作为代表性结果的示例，展示了对硝酸盐含量较高的地下水中病毒的分析结果。
在低至中等污染程度的水体中检测病毒，需要将至少数升水样中的病毒浓缩至更小的体积，该过程通常包括连续进行的两个浓缩步骤。这一略显繁琐的程序以及病毒回收率的不稳定性，显著阻碍了对大量水样进行同步处理。
为了消除两步法程序造成的瓶颈，我们采用了一种在先前研究中开发的一步法方案，该方案适用于多种水体基质。该程序包括：对十升水样进行酸化处理，利用脱脂牛奶进行絮凝，絮凝物通过重力沉降，收集沉淀物并进行离心，将沉淀物重悬于10 ml磷酸盐缓冲液中。所得病毒浓缩液用于提取病毒核酸，并通过qPCR定量目标腺病毒和多瘤病毒。利用这种低成本的浓缩方法，可同时分析大量样品。
该方法已应用于浴场水、海水和河水的分析，本研究中我们展示了对地下水样品的分析结果。这种高通量定量方法具有可靠性高、操作简便和成本效益好的优点。

该研究描述了一种经济有效的方法，利用qPCR对人类/猪/牛源DNA病毒（腺病毒和多瘤病毒）进行特异性定量，以确定水中粪便/尿液污染或硝酸盐污染的来源，上述病毒被提议作为微生物源追踪（MST）工具。

环境中的微生物污染构成重大的健康风险。传统的细菌性粪便指示菌已被证明存在显著……

利用特异性人源和动物源病毒进行微生物溯源的低成本方法。本研究描述了一种利用定量PCR对作为微生物溯源工具提出的人腺病毒、多瘤病毒及人源、猪源、牛源DNA病毒进行特异性定量，从而鉴定水体中粪便污染或硝酸盐污染来源的低成本方法。我们已建立一种从10升水样中浓缩病毒的方案，该方法采用有机絮凝法，通过脱脂牛奶从沉淀物中提取病毒核酸，并利用定量PCR对人源、牛源或猪源DNA病毒进行定量。众所周知，维生素的微生物污染构成重大的健康风险，因此我们需要了解污染的来源。我们提出利用高流行率的DNA病毒作为微生物溯源的追踪工具。所选择的病毒为腺病毒和多瘤病毒。这些病毒全年在所有地理区域持续排出。此前已有相关研究。我们已开发出针对水中病毒的高效低成本浓缩方法，并一直致力于开发用于定量检测禽腺病毒和牛多瘤病毒的QPCR检测方法。此外，我们还使用人腺病毒和NGC多瘤病毒（通过QPCR检测）作为水中人类污染的指示标志物。水样的采集方法如下：在本研究中，每个水样采集四个10升的重复样本，盛装于平底塑料容器中，并额外采集一个样本作为过程对照。最后一个样本将接种已知数量的病毒颗粒作为对照。通过在一个额外的10升塑料容器中使用条件化自来水，在实验室中制备阴性对照。如果样品中含有大量悬浮物质、沙子及其他材料，静置15分钟使其沉淀，然后将上清液转移至新容器中。采用有机絮凝法进行病毒浓缩。在低或中等污染程度的水样中检测病毒，需要将至少数升水中的病毒浓缩至更小的体积。浓缩过程包括：将10升水样酸化，使用脱脂牛奶进行絮凝，重力沉降絮状物，并将沉淀物收集于10毫升磷酸盐缓冲液中以启动后续流程。制备人工海水中脱脂牛奶定位溶液时，需将10克脱脂奶粉溶于1升人工海水中，并用盐酸小心调节pH至3.5，此时应可见絮状物形成。在使用前立即配制该溶液，或在4°C下保存24小时。水样需搅拌并测定其电导率。若电导率低于1.5毫西门子，则需添加海水盐。通过加入盐酸将水样的 pH 值调节至 3.5。记录样品在调节前后的 pH 值，以及所用盐酸的体积。同时应记录电导率。调节pH后，向10升水样中加入100毫升预过滤的脱脂乳（1%），搅拌样品8至10小时，使病毒吸附到絮状物上。对于用作过程对照的加标样品，向样品中加入标准量的对照病毒（例如1毫升）。停止搅拌，静置8至10小时，使絮状物通过重力沉降。16 小时后，通常为次日，即可收集沉淀物。操作时，使用蠕动泵移除上清液。将含有絮状物的沉淀物收集起来，约 500 毫升，置于离心管中。通过添加预调pH为3.5的脱脂牛奶平衡容器，使用高速离心机在4°C下以8,000 ×g离心30分钟。离心停止后，立即小心地从离心机中取出离心罐。非常轻柔地倾倒并弃去上清液。将每个离心管中的沉淀物溶解于磷酸盐缓冲液中，定容至终体积为10毫升，用于病毒的核酸提取与定量。病毒浓缩液用于提取病毒核酸，并通过A-Q-P-C-R方法对目标腺病毒和多瘤病毒进行定量。使用Key Amp病毒RNA小型试剂盒进行核酸提取。对140 µL病毒浓缩液中的病毒进行手动裂解，并将总核酸提取至80 µL。该试剂盒支持使用Key cube等自动化平台。下一步是病毒基因组的定量。可通过使用TaqMan探针的定量PCR，在同一块96孔板中对样品中的病毒拷贝数进行定量，包括人腺病毒、JC多瘤病毒和牛多瘤病毒。由于所有病毒均采用相同的扩增循环数，猪腺病毒应单独使用另一块96孔板进行目标病毒的定量检测。在洁净的独立区域中配制定量 PCR 反应液。反应液配制完成后，将 15 微升分配至每个孔中，包括对照孔。在另一个独立区域中，向各孔加入 10 微升样品的核酸提取物，每个样品需同时进行直接加样和在纯化水中进行十倍稀释，均设复孔；加入模板后每孔总反应体积为 25 微升（15 微升反应液 + 10 微升样品或标准品），然后用粘性封板膜覆盖含有样品的孔。将盖子的另一部分保留用于下一步操作。对DNA标准品悬浮液进行AB稀释：从10⁰到10⁶基因组拷贝数，每个浓度取10微升，设三个重复，使用专用于标准品DNA的微量移液器操作。含有标准品的孔板已预先贴上粘性覆盖膜并进行切割。该图显示了标准品悬浮液样本和对照样本在96孔板中的分布情况。在激活Amplitude Gold 10分钟后，选择适当参数，在合适的系统中进行qPCR。当反应完成后，在95摄氏度下进行40个扩增循环。按照所用设备的用户手册中所述方式存储数据和结果。DNA 的量将定义为在需要时校正稀释倍数后所得数据的中位数。猪腺病毒定量所获得的扩增曲线和标准曲线显示相关系数为 0.999。按照该操作步骤，可接受的斜率值范围为 -3.1 至 -3.6。已针对硝酸盐含量较高的区域的地下水样本，检测了已知的人类和动物病毒，以确定污染来源。所分析的四份重复样本均检出猪腺病毒阳性，平均值为每升7.74 × 10²个基因组拷贝，该结果与采样点周边区域存在猪粪浆有关，证明地下水中存在猪源粪便污染。在所有检测样本中均未发现人类污染。 病毒学数据通过巢式PCR和测序分析得到证实。结论：本研究报道了对地下水样本的分析结果，显示存在猪源性污染，而无人类或牛源性污染。该方法还已应用于浴场水、海水和河水的分析。本文介绍了将这些工具应用于地下水污染源识别的方法，以硝酸盐含量较高为例，说明所开发方法在检测环境中污染源的适用性。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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