Why does electrostatic binding matter for nucleosome deposition?

Electrostatic binding between negatively charged DNA and positively charged APS-functionalized mica ensures stable nucleosome attachment during imaging. This interaction prevents sample displacement and supports consistent topographic data acquisition. Proper charge interaction is essential for reproducible nucleosome visualization.

How does APS concentration affect mica surface preparation?

APS concentration determines the density of amine groups on the mica surface, influencing its positive charge and nucleosome binding capacity. The protocol specifies a working solution derived from 50 mM APS stock diluted in deionized water to optimize surface functionalization. Deviations may lead to overcrowding or poor nucleosome adhesion.

What does constant cantilever deflection enable during AFM scanning?

Maintaining constant cantilever deflection via the feedback loop allows accurate topographic mapping of nucleosome surfaces by adjusting vertical scanner position in real time. This ensures consistent tip-sample interaction force across the scan area. The resulting signal generates high-resolution images showing nucleosome cores as bright blobs with flanking DNA arms.

Why is rinsing with deionized water necessary after nucleosome deposition?

Rinsing removes unbound buffer components such as HEPES and magnesium chloride that could interfere with AFM imaging or cause crystalline artifacts. This step reduces background noise and improves signal-to-noise ratio in topographic data. It is performed gently to avoid displacing bound nucleosomes from the mica surface.

How does scan size adjustment impact nucleosome imaging resolution?

Increasing scan size from 100x100 nm to 1x1 μm allows visualization of larger fields containing multiple nucleosomes while maintaining 512x512 pixel resolution. This adjustment enables statistical analysis of nucleosome distribution and morphology across a broader sample area. The transition is made after initial tip engagement and amplitude optimization to ensure image clarity.

静态原子力显微镜，用于可视化和表征组装的核小体

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

0 views • 5:09 min • July 8th, 2025

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核小体是真核染色质的基本重复单元，由包裹在组蛋白核心上的 DNA 转角组成。

为了通过静态原子力显微镜（AFM）可视化组装的核小体，从一条薄云母条开始，功能化以使表面带正电。将条带切成小方块。移液组装好的核小体悬浮液。

核小体中带负电的 DNA 通过静电相互作用与功能化云母条带的带正电荷基团结合。用缓冲液洗涤以防止核小体过度拥挤。

将

云母条固定在样品支撑盘上。将其安装在 AFM 仪器载物台上。

将

探头支架连接到仪器的光学头上。支架包含一个预装的 AFM 悬臂，其顶端有一个尖端。

将

激光束对准悬臂背面以进行准确的偏转测量。将尖端与含有核小体的表面直接接触。

在接触模式成像期间，当悬臂尖端扫描核小体表面时，尖端原子和样品之间的相互作用后会产生排斥力。这会导致悬臂弯曲。激光束以不同的方式反射并引导至位置敏感光电探测器。

反馈回路在扫描过程中通过扫描仪的垂直移动保持恒定的悬臂偏转。该反馈信号进一步用于生成形貌核小体图像。核小体核心表现为明亮的斑点，细臂代表侧翼 DNA。

准备用于静态 AFM 成像的云母表面。为此，首先在去离子水中制备 50 毫摩尔的 APS 储备溶液。将 1 毫升等分试样的溶液储存在 4 摄氏度下，直到需要为止。

从储备溶液中，通过将 50 微升 50 毫摩尔 APS 储备液溶解在 15 毫升蒸馏去离子水中，制备用于云母修饰的工作 APS 溶液。混合溶液，然后，将溶液填充比色皿。

接下来，从优质云母片上切下 1 x 3 厘米的云母条。检查该部件在斜放置在比色皿中时是否适合。然后，劈开云母层，直到两面都刚裂开，并且云母薄至 0.1 毫米。

立即将云母片放入充满APS的比色皿中，并将云母孵育30分钟。将云母片转移到装有蒸馏去离子水的比色皿中，浸泡 30 秒。然后，使用氩气将 APS-云母条的两面完全干燥。

将

双面胶带贴在几个磁性圆盘上，然后将它们放在一边。然后，将APS-云母基板切成1厘米乘1厘米见方，并将它们覆盖在干净的培养皿中。接下来，使用含有 10 毫摩尔 HEPES 和 4 毫摩尔氯化镁的 0.22 微米过滤缓冲液，pH 值为 7.5，制备组装核小体的三种稀释液。

为了限制低终浓度下核小体的损失，应在沉积在APS-云母上之前一次稀释一个。

将

5 至 10 微升每个核小体样品沉积在 APS-云母片的中心，并让它们孵育 2 分钟。然后，用 2 至 3 毫升蒸馏去离子水轻轻冲洗样品以去除缓冲液成分，并在轻氩气流下干燥沉积的样品。

首先，将吸头安装在 AFM 设置的吸头支架上。然后，将第一个样品安装在 AFM 载物台上，注意不要接触样品表面。将激光器放在悬臂上，直到其总和达到最大值，并将垂直和横向偏转值调整到接近 0。然后，调整 AFM 探针以找到其共振频率。调整驱动幅度，并将图像大小设置为 100 x 100 纳米。设置完成后，单击"参与"按钮开始方法。

进近完成后，逐渐优化振幅设定点，直到清楚地看到样品表面。然后，将扫描尺寸增加到 1 微米 x 1 微米，分辨率增加到 512 x 512 像素。最后，单击捕获按钮开始图像采集。