使用扫描电子显微镜定量膜褶皱形成

外部刺激器激活细胞并诱导三维圆形膜突出或膜褶边形成，这对于各种细胞活动至关重要。

要可视化膜褶边的形成，请从底部包含盖玻片的多孔板开始。盖玻片的顶部有培养的巨噬细胞。

用激活细胞的刺激分子处理这些巨噬细胞，促进细胞骨架重组和膜突起的形成。用固定溶液覆盖细胞，交联蛋白质，并保留细胞结构。

用增加酒精浓度处理固定巨噬细胞以使其完全脱水。使用临界点干燥器干燥这些巨噬细胞，消除任何水痕迹，以获得更好的成像效果。

使用导电胶带将盖玻片安装到扫描电子显微镜或SEM样品架上。溅射在含有巨噬细胞的盖玻片上涂上一层薄金属层，确保成像过程中良好的电子导电性。

将盖玻片放入SEM室中。将电子束聚焦在盖玻片上。电子束撞击金属涂层巨噬细胞的膜，导致膜表面产生低能二次电子。

三维突起散射电子的方式与膜的其余部分不同，突出了细胞表面的这些特征。探测器从各个细胞表面区域收集散射电子，生成对比图像。

在SEM图像中，巨噬细胞看起来颜色较深，表面有明亮的圆形突起，证实了褶皱的形成。

首先使用高压灭菌镊子将无菌玻璃盖玻片放入 24 孔板的孔中。然后，将RAW 264.7巨噬细胞以每毫升10⁶个细胞的密度接种到盖玻片上，并将板在37摄氏度和5%二氧化碳的加湿培养箱中孵育过夜。

第二天，用500微升新鲜完全培养基替换每个孔中的培养基，然后，用载体对照（如DMSO）或巨胞饮作用抑制剂（如EIPA）对巨噬细胞预处理30分钟。接下来，为了促进膜褶皱，用巨胞饮作用刺激剂处理细胞30分钟，例如1微摩尔PMA溶液或每毫升100纳克巨噬细胞集落刺激因子。

要固定用于扫描电子显微镜的细胞，请从孔中吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤盖玻片两次。然后，将盖玻片在室温下在固定剂中孵育30分钟，然后在4摄氏度下孵育过夜。

第二天，在不干扰细胞单层的情况下，轻轻洗涤，然后将盖玻片在 500 微升 0.1 摩尔二甲胂酸钠中孵育 15 分钟。用 500 微升蒸馏水洗涤两次后，在 500 微升分级乙醇系列中洗涤盖玻片两次，每次洗涤孵育 10 分钟。

要进行临界点干燥，请将盖玻片放入临界点干燥器中，并用 100% 乙醇覆盖，然后按下电源按钮，打开二氧化碳罐。按住冷却按钮约 30 秒，直到温度降至 0 摄氏度。然后，按"填充"按钮，直到腔室窗口中出现气泡。

接下来，按下"吹扫"按钮，直到吹扫排气中的乙醇气味消失。然后，再次按下冷却按钮，直到温度降至 0 摄氏度。重新按下填充和清除按钮将其关闭。然后，关闭二氧化碳罐。重新按下冷却按钮将其关闭，然后按加热按钮。将温度设置为 42 摄氏度，压力设置为每平方英寸 1,200 磅。

压力和温度稳定下来，按下放气按钮让压力缓慢降低。一旦腔室压力达到每平方英寸 150 磅，按下通风按钮并等待压力降至每平方英寸 0 磅。关闭临界点干燥器，并取下盖玻片。

接下来，使用碳胶片，将盖玻片安装在铝制样品支架上，用于扫描电子显微镜。然后，在溅射镀膜机中使用金或钯进行溅射镀膜。

溅射镀膜机的电源按钮。真空度达到 30 毫托后，关闭燃气开关并逆时针转动细气阀，冲洗腔室以去除湿气和空气。一旦真空度增加到 200 毫托，关闭气体开关并等待真空度达到 30 毫托，然后再次冲洗腔室以去除湿气和空气，如图所示。冲洗腔室三次后，按下定时器按钮并调整电压旋钮，直到仪表读数为 10 毫安。然后，从腔室中取出涂层盖玻片。

要可视化和量化膜褶边，请将样品盖玻片插入扫描电子显微镜的腔室中。关上门并按下 Evac 按钮。打开显微镜作软件，将加速电压设置为15千伏，工作距离设置为10毫米。按坐标按钮并在控制器周围移动，直到单元格出现在观察屏幕的中央。将放大倍率设置为 3500 倍，然后单击"照片"按钮对样品进行成像。