Name: 凸出力显微镜: 一种量化细胞突起力的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习使用原子力显微镜量化巨噬细胞伪足小体在柔性薄膜上产生的突起力。该方法通过测量薄膜形变并结合力学模型将形变转换为力值，为研究细胞黏附机制与细胞力学提供重要技术手段。

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作者感谢 Anna Labernadie、Guillaume Charrière 和 Patrick Delobelle 对本研究的初期贡献，感谢 Matthieu Sanchez 和 Françoise Viala 在视频拍摄与编辑方面的帮助。本工作得到了法国国家研究署（ANR14-CE11-0020-02）、法国医学研究基金会（FRM DEQ2016 0334894）、法国国家健康与医学研究院癌症计划（INSERM Plan Cancer）、图卢兹癌症基金会以及人类前沿科学计划（RGP0035/2016）的资助。

1. 甲酸盐薄膜包被载网的制备
<ol>
	<li>用纯丙酮清洗透射电镜载网，并在滤纸上晾干。随后用纯乙醇清洗载玻片，用镜头纸擦拭，并用吹气球去除灰尘。</li>
	<li>将经乙醇清洁的玻璃载玻片垂直放入薄膜浇铸装置的漏斗中，漏斗下部含有Formvar溶液。盖上漏斗顶部。</li>
	<li>用喷雾器将100 mL聚乙烯醇缩甲醛溶液（0.5%溶于二氯乙烷）泵入载玻片，直至液面达到载玻片高度的三分之二。</li>
	<li>将载玻片置于溶液中 1 分钟。</li>
	<li>打开装置的阀门，使Formvar溶液以稳定流速排出。流速控制在10至15 mL/s时，可获得厚度为30–80 nm的Formvar膜。膜的厚度取决于Formvar溶液的浓度和排液速率。 
	注意：可通过释放压力来控制排水速率 通过 通过缓慢打开阀门来开启排气阀。排水越快，膜越厚。实践中，由于难以根据Formvar的流速预测膜的厚度，我们制备多批Formvar膜，并通过原子力显微镜（AFM）控制其厚度（见步骤2）。</li>
	<li>从培养室中取出载玻片，并用滤纸轻轻吸干以去除残留的液态Formvar。</li>
	<li>用剃刀从Formvar膜上切割出一个20 mm × 50 mm的矩形。</li>
	<li>将烧杯装入洁净的蒸馏水，然后缓慢将载玻片垂直浸入水中，使膜脱离并漂浮于水面：膜应漂浮在水面上。</li>
	<li>将经丙酮清洁并干燥的载网放置于膜上，光面朝上。</li>
	<li>放置一个圆形玻璃盖玻片（&#216; 将盖玻片（12 mm）放置在部分载网之上，用于测量膜的厚度（见步骤2）。</li>
	<li>用裁剪至合适大小的白色贴纸覆盖载玻片。将载玻片垂直浸入漂浮的Formvar膜边缘，直至整个膜附着在载玻片上。用滤纸吸去载玻片上的多余水分，并在室温下静置过夜使其干燥。</li>
</ol>
2. 薄膜厚度的测量
<ol>
	<li>用镊子在盖玻片周围的Formvar膜上剪开，使其从载玻片上分离。</li>
	<li>用笔标记盖玻片下方网格的位置。</li>
	<li>在已标记的网格周围剪开Formvar膜，使其从盖玻片上分离。这样在剩余的Formvar膜上会留下一个孔洞，可用于测量膜的厚度。用PBS覆盖盖玻片，并将其放置在显微镜的玻璃载片上。</li>
	<li>将氮化硅悬臂安装到AFM玻璃块上，确保金条纹未被弹簧尖端覆盖。 
	注意：悬臂的灵敏度和弹簧常数应已在PBS中完成校准。</li>
	<li>将玻璃块安装到AFM模块上，然后将模块放置到显微镜上。</li>
	<li>将涂有Formvar的盖玻片放入观察室，并加入500 µL PBS覆盖。</li>
	<li>使用原子力显微镜（AFM）接触模式和0.5 nN的设定力，扫描Formvar膜上孔洞的边缘。</li>
	<li>以玻璃盖玻片表面作为高度测量的参考，通过截面高度评估Formvar膜的厚度（每批Formvar膜至少进行10次测量）。</li>
</ol>
3. 在网格上接种细胞
<ol>
	<li>在无菌操作台内，将一条双面胶带（12 mm × 3 mm）贴在盖玻片上。</li>
	<li>用镊子夹取一片涂有Formvar的载网，将其倒置放在胶带条上（仅需将载网边缘粘附在胶带上）。Formvar膜必须朝向盖玻片一侧。</li>
	<li>将此装置放入培养孔中。</li>
	<li>加入10 µL不含FCS的RPMI培养基，其中含有由人单核细胞分化而来的104个巨噬细胞16。 
	注意：加样时确保移液器枪头不接触载网，以免损坏Formvar涂层。</li>
	<li>于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，使细胞贴附。</li>
	<li>向孔中补加2 mL含10% FCS的RPMI培养基。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下继续孵育2小时，使细胞充分贴附，随后进行原子力显微镜（AFM）观察。</li>
</ol>
4. 由巨噬细胞足体诱导的形变的形貌测量
<ol>
	<li>在玻璃底培养皿上粘贴两条双面胶带。 
	注意：两条胶带之间的距离应小于网格的直径。</li>
	<li>小心地将接种有巨噬细胞的网格从胶带上取下。</li>
	<li>将网格翻转，使细胞面朝向玻璃，然后将网格固定在两条双面胶带之间。</li>
	<li>用两条新的双面胶带固定网格，使网格被夹在两层胶带之间，从而让网格的中央区域可被原子力显微镜（AFM）探针接触。 
	注意：确保网格固定牢固且无扭曲；否则AFM悬臂可能无法接近Formvar表面。</li>
	<li>向培养皿中加入2 mL预热至37 °C的培养基（含10%胎牛血清的RPMI），并添加10 mM HEPES（pH 7.4）。</li>
	<li>将培养皿置于37 °C的加热板上。</li>
	<li>将加热板安装到AFM载物台上。</li>
	<li>让系统稳定在37 °C。</li>
	<li>在接触模式下以0.5 nN的力进行首次全局成像以定位小体结构，随后以约20 nm的像素尺寸、3 Hz的扫描速率对Formvar表面形貌进行扫描。 
	注意：避免在网格边缘附近进行扫描。</li>
</ol>

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</ol>

未声明任何利益冲突。

材料特性
在我们的实验中，可变形膜材料的选择（以Formvar为例）需要满足若干要求。该材料必须对可见光透明，并具有较低的自发荧光，以便在明场和荧光显微镜下进行观察。薄膜的表面粗糙度必须远低于10 nm，以避免对细胞黏附产生拓扑效应，并确保可通过原子力显微镜（AFM）清晰观察到细胞诱导形成的突起结构。最后，膜的刚度（取决于材料的杨氏模量和厚度）需足够高，以促进podosome的形成，同时在典型podosome位点产生的应力（约为10–100 kPa）作用下仍保持可观测的形变能力。厚度为30–80 nm的Formvar薄膜在上述各项约束条件之间达到了良好的平衡。值得注意的是，通过调节Formvar膜的厚度，可调控其刚度，从而研究podosome的力学感知特性7。
Formvar 制备的可重复性与质量
某些批次的火棉胶膜会在载网上产生褶皱，因此无法使用：这一点可...

动物细胞与其所处环境中的基质及其他细胞发生物理相互作用1。这种相互作用对于细胞的迁移、吞噬颗粒、获取外界信息或分化等过程至关重要。在这些过程中，细胞必须产生机械力；近年来大量研究表明，细胞产生机械力并探测其周围环境的能力会影响其生物学行为，例如调控细胞增殖或分化2,3。因此，对细胞力的测量成为研究力生成调控机制的重要手段，并有助于理解其在细胞行为和组织命运决定中的作用4,5。
近年来，已开发出多种技术用于测量细胞对其周围环境施加的力6。其中大多数技术在揭示细胞牵拉可移动探针或可变形基底时所产生的牵引力方面发挥了重要作用。然而，对于细胞向细胞外环境突出过程中所涉及的机械力，目前仍缺乏有效的测量手段，其特征至今尚不明确。
为了克服这一局限性，我们提出了一种测量细胞施加于基底垂直方向上作用力的方法。该方法包括将活细胞接种在可沿垂直方向发生形变的薄弹性基片上，从而能够测量细胞引起的基底形变，并据此推导出相关作用力。基底的表面形貌通过原子力显微镜以纳米级分辨率进行测量，而由形变评估作用力则依赖于对细胞突出结构几何特征的了解7,8,9。
本文描述了该装置的设置及其在测量巨噬细胞在三维环境中进行间充质迁移时所形成的 podosome（突起性黏附结构）产生之力的应用10,11,12,13,14,15,16,17。我们相信，该技术将推动对涉及细胞突起的多种细胞过程中力的产生及其调控机制的理解。

<table><tbody><tr><td>200目镍网格</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>白色标签 26 × 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>出口带阀门的成膜装置</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>0.5% 甲酰膜乙二氯溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>原子力显微镜</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>温度控制样品台&amp;nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>标称弹性常数为 0.01 N/m 的氮化硅悬臂梁</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

细胞突起力显微技术：一种量化细胞突起产生作用力的方法

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

在多种生物学背景下，动物细胞需要通过产生机械力与周围环境发生物理相互作用。其中，牵引力已被充分表征，但目前尚缺乏能够测量细胞垂直于基底方向施加的突出力的技术。我们设计了一种实验装置，用于测量贴壁细胞对其基底施加的突出力。接种在可变形的Formvar膜上的细胞会使其基底发生形变，随后通过原子力显微镜（AFM）在纳米尺度上对所产生的表面形貌进行成像。然后，基于突出性细胞结构的几何特征分析形变轮廓，从而提取出力的数值。因此，可以随时间测量活细胞中各个突出单元所施加的力。该技术将有助于研究涉及细胞突出的多种细胞过程中力的产生及其调控机制。本文中，我们描述了该方法在测量人巨噬细胞形成的浆膜足（podosomes）所产生的突出力中的应用。

上述方案描述了如何制备实验装置，以定量测定巨噬细胞足体在 Formvar 基底上施加的突出力。该过程使用原子力显微镜（AFM）实现，如图1所示。
使用 JPK 数据处理软件分析 podosome 下方隆起结构的形貌图像时，应对每条扫描线独立减去三阶多项式拟合。可通过在图像侧边添加 z 颜色标尺来评估 podosome 诱导隆起的最大高度。导出为 TIFF 格式后，进一步使用在线提供的专用自制 ImageJ 宏对形貌图像进行分析8。该宏可根据给定参数（Formvar 膜厚度和 podosome 环半径）在修正后的高度图像上定位隆起结构，并生成力图（图 2）。此外，该宏还会生成一个文本文件，记录 Formvar 表面上每个检测到的隆起结构的坐标、高度及计算得到的力值。
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本文详细介绍了用于评估 podosome 对可变形薄膜施加的突出力的实验技术，内容涵盖薄膜的制备到形貌图像的自动化分析。

在多种生物学背景下，动物细胞需要通过产生机械力与周围环境发生物理相互作用。其中，牵引力……

本实验的总体目标是利用原子力显微镜定量测定细胞突起力。首先制备涂有特定配方的网格，并测量该薄膜的厚度。此过程的第三步是将细胞接种于网格上，并使其贴壁。该实验步骤的最后一步是使用原子力显微镜对细胞下方的形变薄膜进行成像。当巨噬细胞黏附于基底时，会形成称为 podosome 的亚微米级黏附结构。最终，podosome 引起的薄膜形变将通过自主开发的力学模型进行量化，并转换为作用力。将一块经乙醇清洁的玻璃片放入漏斗式成膜装置中，并盖住漏斗顶部。将明胶溶液倒入漏斗中，直至液面达到载玻片高度的三分之二处。静置一分钟，然后以稳定流速排净明胶溶液。请注意，薄膜的厚度取决于流速和福尔马林溶液的浓度。轻轻拍干并用锋利的剃须刀片切出矩形。将载玻片浸入装有蒸馏水的烧杯中，使福尔马林膜漂浮到水面上。将经丙酮清洁的载网小心地放置在薄膜上，光面朝上，并在其中一些载网上放置直径为12毫米的盖玻片。这些将用于厚度评估实验。最后，用贴有标签的载玻片浸入以回收整个薄膜和载网。用镊子沿玻璃覆盖的盖片边缘划出轮廓，以切割Formvar膜并将其从载玻片上剥离。将网格位置置于覆盖的盖片下方，再用镊子勾勒网格轮廓，将其撕下。由此在Formvar膜上形成的孔洞将用于成像，以测量其厚度。将硅氮化物悬臂安装在AFM玻璃块上，确保金色条纹不位于弹簧尖端下方。将玻璃块安装到AFM模块上，然后将该模块放置在显微镜载物台上。将涂有聚乙烯醇缩甲醛的盖玻片放入观察室，并在其上方加入PBS溶液。在接触模式下，使用0.5纳牛的力扫描Fomvar与玻璃之间的边界。在数据处理软件中，以玻璃表面作为高度参考，测量横截面上Fomvar的厚度。在无菌操作台中取出一个12毫米的盖玻片，并在其上粘贴一条带孔胶带。用镊子勾勒出覆有明胶膜的载网轮廓，并将其光面朝上放置，使其仅边缘与粘合剂接触。此举可防止在将载网从胶带上取下时明胶膜被撕裂。将盖片放入无菌的六孔板中，并用移液器加入10毫米的无血清培养基液滴。样品应包含约10,000个细胞，此处为由人单核细胞分化而来的巨噬细胞。操作过程中切勿让移液器吸头接触载网，以免损坏聚乙烯醇缩醛（Fomvar）涂层。孵育30分钟使细胞贴壁，随后加入含血清的培养基补满孔板，再继续孵育2小时，然后进行原子力显微镜（AFM）观察。在玻璃底培养皿上放置两条平行的双面胶带，确保两条胶带之间的宽度略小于您的网格直径。然后将先前接种了细胞的网格取下，细胞面朝下放置在两条胶带之上。再在上方贴上另外两条胶带，以固定网格。加入预热并添加了 HEPES 的培养基至培养皿中。将培养皿放入已预设为 37 摄氏度的培养皿加热器中。将装置安装在原子力显微镜（AFM）载物台上。当系统温度稳定在 37 °C 时，开始对 Fomvar 表面进行扫描，扫描应在接触模式下进行，设定点为 0.95 nN，并在偏转数据视图窗口中观察与原生动物相关的形变。以下是利用原子力显微镜（AFM）获得形貌并进行图形测量的代表性结果及处理步骤。如图所示，可在 Fomvar 表面上检测到隆起结构。为了将该照片信息转换为力值，首先需要获取局部高度差。为此，应对扫描线独立地减去一个三次多项式拟合结果。然后，利用自主开发的专用图像算法，结合基于原生动物介导突起的力学模型，从原子力显微镜高度图中评估突起力的数值。通过该实验步骤，我们能够研究原生动物中突起力生成所涉及的机制。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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生物学

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