凸出力显微镜: 一种量化细胞突起力的方法
2018年6月16日
在这里, 我们详细介绍了用于评估 podosomes 在兼容薄膜上应用的突出力的实验技术, 从薄膜的制备到地形图像的自动分析。
该程序的总体目标是使用原子力显微镜量化突起力。这是通过首先准备配方涂层网格并测量该薄膜的厚度来实现的。此过程的第三步包括将单元放在网格上并让它们粘附。
该程序的最后一步是使用原子力显微镜对细胞下方的形成膜进行成像。当粘附在基材上时，微噬细胞形成亚微米粘附结构，称为足小体。最终，足小体使用的薄膜变形将被量化并使用自制的机械模型转换为力。
将乙醇清洁玻璃灯放入漏斗薄膜流延装置中，并盖上漏斗顶部。将 fomvar 溶液向上平移到漏斗中，直到水平达到玻片的三分之二。静置 1 分钟，然后以稳定的流状沥干 formvar 溶液。
请注意，薄膜的厚度取决于流速和 formvar 溶液的浓度。将这个光轻轻拍干，然后用锋利的剃须刀片切出矩形。将载玻片浸入装满蒸馏水的烧杯中，使 fomvar 薄膜漂浮到水面上。
小心地将丙酮清洁网格放在薄膜上，闪亮的面朝上，其中一些薄膜顶部有 12 毫米直径的盖玻片。它们将用于厚度评估实验。最后浸入覆盖有贴纸的载玻片以恢复整个薄膜和网格。
用镊子勾勒出玻璃覆盖的玻片，以切割 formvar 并将其从载玻片上分离。将网格的位置安装在有盖的玻片下方，然后用镊子勾勒出网格以将其拉下。由此产生的 fomvar 薄膜上的孔将被成像以测量其厚度。
在 AFM 玻璃块中安装一个硝酸硅连续物，确保金色条纹不在弹簧尖端下方。将玻璃块安装到 AFM 模块上，然后将后者放在显微镜载物台上。将涂有 fomvar 的盖玻片放在观察室上，PBS 在顶部。
在接触模式下用 0.5 纳牛顿点扫描 fomvar 和玻璃之间的边界。在数据处理软件中，使用玻璃表面作为高度参考，并测量横截面上的fomvar厚度。在无菌罩下，挑选一个 12 毫米的盖玻片，并在其上贴一条孔边胶带。
用镊子勾勒出 fomavr 涂层网格，并将其正面朝上放置，这样它只会在侧面附着在粘合剂上。这是为了防止在从磁带上移除网格时 fomvar 被撕裂。将盖条放入无菌的 6 孔板中，并管入 10 毫米无血清培养基液滴中。
它应该包含大约 10,000 个细胞，在这种情况下，这些是从人类单核细胞分化而来的微噬细胞。在此过程中，请确保不要用吹蛱嘴尖端接触网格，以免损坏 fomvar 涂层。孵育半小时让细胞粘附，然后用补充血清的培养基填充孔，并在 AFM 观察之前再次孵育 2 小时。
将两条平行的双面胶带放在玻璃底培养皿上，确保它们之间的宽度与网格直径相比略小。然后分离先前播种有细胞的网格，并将其放在两个带条的顶部，细胞朝下。通过在以前的条带上放置另外两个条带来修复网格。
用预热的培养基填充培养皿，并补充 hepe's。将培养皿放入之前设置为 37 摄氏度的培养皿加热器中。在 AFM 载物台上安装该装置。
当系统温度稳定在 37 摄氏度时，继续扫描 fomvar 表面，这应该在接触模式下进行，具有 0.95 纳牛顿设定点，并在挠度数据视图窗口上看到原生动物相关的变形。以下是使用 AFM 将地层生成到图形测量的代表性结果和处理步骤。正如您在这张图片上看到的，检测到 fomvar 表面上的凸起。
为了将此照片信息转换为力值，必须首先访问局部高差值。为此，应将三阶多项式拟合独立减去到其扫描线。然后，使用自制的专用图像算法可以从 AFM 高度图和原生动物介导的突起的机械模型中评估突起力值。
由于该程序，我们能够研究原生动物产生突起力所涉及的机制。感谢您的观看，祝您的实验好运。
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概述
本文详细介绍了用原子力显微镜量化通过假足体对柔性薄膜施加的突起力的实验技术。该过程包括薄膜制备、细胞粘附和成像，以分析假足体引起的变形。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- 假足体是由巨噬细胞形成的亚微米粘附结构。
- 了解假足体施加的力可以提供细胞力学的洞察。
- 原子力显微镜是测量这些力的关键技术。
- 该研究旨在基于薄膜变形开发量化力的机械模型。
研究目的
- 量化假足体施加的突起力。
- 分析细胞与柔性基底之间的相互作用。
- 加深对细胞粘附机制的理解。
使用的方法
- 配方涂层网格的制备。
- 薄膜厚度的测量。
- 细胞在网格上的定位以进行粘附。
- 使用原子力显微镜成像细胞下方的薄膜。
主要结果
- 量化假足体引起的薄膜变形。
- 使用机械模型将变形测量转换为力值。
- 对假足体与基底相互作用的机械性质的见解。
- 展示原子力显微镜在测量细胞力方面的有效性。
结论
- 该研究成功量化了假足体的突起力。
- 研究结果有助于理解细胞力学和粘附。
- 所开发的方法可应用于细胞生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantifying protrusion forces provides a direct readout of cellular mechanical activity, enabling mechanistic de-risking in target validation for macrophage-related pathways. This method supports predictive confidence by linking subcellular force generation to functional phenotypes in adhesion and migration. It positions protrusion force measurement as a translational biomarker platform for preclinical model de-risking in immunology and inflammation programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying force generation from subcellular protrusive structures like podosomes.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct measurement of force-dependent cellular functions in human macrophages.
- Predictive Value: Links protrusion force dynamics to pathway clarification, aiding portfolio triage in mechanosensitive target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, reproducible nanoscale topography maps from compliant substrates for quantitative force extraction.
- Scalability: Enables preparation of validated biological systems (e.g., podosome-forming macrophages) for downstream compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates reliable compound evaluation by providing a mechanical phenotype readout orthogonal to biochemical assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage protrusion force measurements to preclinical validation through disease-relevant macrophage models.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by quantifying force generation as a functional output of podosome activity.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by correlating protrusion force modulation with target engagement in adhesion pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing a quantitative, mechanistically grounded readout of cellular protrusion dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by measuring force generation from defined protrusive structures.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible height maps from AFM imaging that enable quantitative comparison of protrusion forces across conditions.
- Analytics: Generates force values via mechanical model conversion of deformation profiles, enabling statistical comparison of protrusive activity.
- Translational Research: Aligns with preclinical continuity by using human macrophage-derived podosomes as a disease-relevant system for mechanistic insight.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for probing mechanobiology across immune, cancer, and inflammation targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protrusion-driven processes.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through AFM-based nanoscale deformation mapping and controlled substrate preparation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early biological de-risking of targets involved in force-generating cellular structures.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by quantifying protrusion force as a functional biomarker for target modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in atomic force microscopy operation, compliant polymer film preparation, and macrophage cell culture.
- Depends on instrumentation capable of nanoscale height mapping and force curve acquisition in liquid environment.
- Necessitates cross-team standardization of film thickness measurement, cell seeding density, and AFM set-point force for reproducible protrusion detection.
- Involves adaptation considerations when applying to non-macrophage cell types or alternative protrusive structures beyond podosomes.
- Limited by the need for homogeneous, defect-free compliant films and accurate mechanical modeling of protrusion-substrate interactions.
