Name: 阵列断层扫描工作流程，用于使用扫描电子显微镜有针对性地采集体积信息 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 学习阵列断层扫描工作流程，利用扫描电子显微镜采集体积信息。该方法通过制备连续超薄切片，实现大样本中稀有目标结构的高效定位与成像，显著缩短数据采集时间并简化分析流程。

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我们感谢洛桑大学电子显微镜平台的成员在AT技术不同步骤开发过程中提供的支持。感谢Gareth Griffiths、Marta Rodrigues、Urska Repnik、Christel Genoud、Helmut Gnaegi、Einat Zelinger、Paola Moreno-Roman、Lucy O'Brien和Lindsay Lewellyn在稿件撰写过程中参与讨论并提出宝贵的修改意见。我们谨向为本研究提供样本以展示不同应用场景的课题组表示感谢：Matthias Lutolf、Michail Nikolaev、Devanjali Dutta、Till Matzat和Fanny Langlet团队。

注意：样品制备方法在其他文献中有详细描述14,30,31，本文未予涵盖。简而言之，所示样品先用戊二醛化学固定，再用1% OsO4进行后固定，然后在包埋于包埋树脂前用1%醋酸铀酰水溶液处理。或者，样品也可采用高压冷冻法固定，随后在丙酮中用0.1%醋酸铀酰进行冷冻置换，最后包埋于丙烯酸树脂中。样品块采用平面包埋法制备，该方法可清晰观察样品，便于切片时进行定位（图1B）。
1. 芯片生成流程
<ol>
	<li>包埋样品的定位与修块
	<ol>
		<li>使用双目镜/显微镜，通过剃须刀片在包埋块表面轻轻划痕，识别并标记感兴趣区域（ROI）。这有助于在超薄切片机中对样品进行定向，并减少切片面积。</li>
		<li>将样品固定在超薄切片机的样品夹上（图2A）。</li>
		<li>用剃须刀片先对样品周围的树脂进行粗修，再使用金刚石修块刀进行精细修块（图2A）。使用刃角为20°或90°的刀具，以确保包埋块的顶面和底面与刀刃切割边缘平行。 
		&#8203;注意：此步骤对连续切片和获得平直的切片带至关重要。</li>
		<li>按3:1比例混合二甲苯与胶水，用粘附在牙签上的睫毛将该混合物涂抹于修好的包埋块顶部和底部边缘。待其充分干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备阵列支撑材料A（即硅片）
	<ol>
		<li>使用硅片切割工具（EMS）切割硅片，并根据实验需求调整尺寸。2 cm × 4 cm 的尺寸适用于光学显微镜和电子显微镜观察。</li>
		<li>用蒸馏水清洗硅片，去除碎屑。</li>
		<li>使用标准设备进行辉光放电/等离子清洗。具体参数取决于所用仪器。可先采用载网放电的参数，并根据经验调整处理时间。此步骤对切片在支撑材料上干燥过程中的良好展开至关重要，不可省略。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备阵列支撑材料B（即玻璃盖玻片）
	<ol>
		<li>若计划进行多重免疫标记实验，应将样品转移至盖玻片上，以便更好地检测荧光信号。为提高盖玻片的粘附性，可采用先前描述的明胶包被详细步骤9。</li>
		<li>通过蒸发镀膜法在载玻片表面镀上氧化铟锡（ITO）或金，以提高导电性。将制备好的盖玻片保存在洁净环境中。按照步骤1.2.3所述进行辉光放电处理。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品切片
<ol>
	<li>AT刀具准备 
	注意：为生成切片阵列，使用一种经过改造的刀具（ATS），该刀具设计用于便于获取长条状切片带。Histo-Jumbo刀具&#160;或类似专为在大面积支撑材料上制备切片而设计的刀具，也可用于AT切片。
	<ol>
		<li>使用泡沫胶带将针固定在刀具底部并刺穿之（图2B）。将ATS刀具安装至超薄切片机的持刀架上，角度设为0°。按照标准操作程序，调整刀刃与样品块表面平行。</li>
		<li>将修整好的样品块移至刀刃边缘，准备开始切片。</li>
		<li>将晶圆/盖玻片放入刀槽内，并加水至与刀刃齐平。确保刀具的金刚石刃口充分润湿，必要时使用附带的注射器吸除多余水分（图2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>切片阵列的制备与转移
	<ol>
		<li>将切片机设置为所需的切片参数。使用ATS刀具时，建议切片厚度为50–100 nm，切片速度为0.6–1 mm/s。开始切片（图2Di）。</li>
		<li>获取一段足够长度的切片带以覆盖目标z轴体积，随后停止收集。根据样品块大小、组织均一性及树脂类型，切片带可能相对平直（图2D-ii）。尽管已投入努力并使用特定刀具，许多样品仍无法产生完全平直的切片带。</li>
		<li>根据最终目标，可制备一条长切片带或数条短切片带并排排列。一块2 cm × 4 cm的支撑材料可方便地承载100至1,000张切片。将切片带排列于支撑材料上的步骤需要技巧和稳定的手部操作，但该技能的学习曲线较短，易于掌握。</li>
		<li>使用粘有洁净无粘性睫毛的牙签轻触刀刃，使切片带从刀刃上脱离（图2Diii）。</li>
		<li>用睫毛轻轻将切片带移至支撑材料中心上方。此时如需展平切片，可使用氯仿或加热笔。但需注意，此类操作可能导致切片带断裂或变形。</li>
		<li>通过拉动注射器开始排水。对于更脆弱的切片带或需要更缓慢排水的情况，可将注射器从软管上取下，让水自然滴落。当水位降至晶圆表面高度时，控制切片带位置，必要时轻轻推动使其居中。待切片带完全沉降于晶圆表面后，继续排水直至刀槽内残留水分完全排尽。 
		注意：若未使用底部排水型ATS刀具，应小心从ATS刀具两侧缓慢减少水量，避免产生湍流。</li>
		<li>将切片连同支撑材料留在水槽中，使其彻底干燥。根据支撑材料的疏水性及环境湿度水平，水分蒸发速率会有所不同（图2Div）。缓慢干燥样品至关重要，以减少或完全避免样品出现褶皱。</li>
		<li>将干燥后的样品转移至密封盒中，防止灰尘污染，并置于60 °C烘箱中至少30分钟。如有需要，可使用重金属对切片进行复染，以增强整体对比度。</li>
		<li>操作结束后，严格按照制造商说明小心清洁刀具。 
		注意：将多个或连续切片转移至晶圆（图2E）与转移至网格载网（图2F）相比，会彻底改变透射电镜（EM）样品制备的体验。在单一支撑材料上连续切片并收集，可显著减少传统连续切片过程中常见的切片与收集错误。一张晶圆上收集的100张尺寸为1000 µm × 500 µm的切片，相当于33张网格载网的容量（图2G）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品观察
注意：本节所述工作流程步骤使用一种市售软件实现（参见材料表）。虽然任何配备正确探测器的扫描电镜（SEM）上的图像采集软件均可使用，但具体用户操作会有所不同，且通常需要更多手动操作。
<ol>
	<li>获取扫描电子显微镜（SEM）图像的概览图，以显示晶圆上各切片的位置。内置的光学相机图像有助于定义覆盖一排切片或所有切片的SEM图像拼接图。通过在样品的相机图像上使用鼠标右键点击并拖拽，创建拼接图，并启动自动采集。 
	注意：使用非常粗糙的成像参数即可，例如1-2 µm的像素尺寸和1 µs的停留时间。该过程详见补充材料（第2-7页）。</li>
	<li>使用切片查找自动检测功能或手动方式定位切片。该软件基于图像匹配自动获取切片的位置和轮廓。此过程的示例见补充材料（第8-15页）。</li>
	<li>若概览图像未能清晰显示感兴趣区域（ROI），则对切片进行更高分辨率的成像。使用切片预览功能自动创建并采集图像。该过程详见补充材料第16-18页。成像参数的选择应根据用户所寻找的ROI的性质和大小而定。
	<ol>
		<li>为找到最佳参数，激活显微镜控制软件中的实时成像功能，并导航至一个ROI。调整成像参数，直至图像能清晰显示ROI，同时确保图像采集时间不过长。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义成像区域 
	&#8203;注意：提供多种不同策略。
	<ol>
		<li>若仅需对少数切片进行成像，可利用迄今已创建的切片图像导航至相关切片，并使用可缩放查看器（Zoomable Viewer），该查看器以原始相对位置显示所有已采集图像，以便查看所有切片。一旦发现需要高分辨率成像的切片，可通过点击并拖拽定义一个成像区域。选择高分辨率成像参数，并将这些参数保存为模板，以便后续切片重复使用。</li>
		<li>为寻找特别微小或难以检测的稀有事件，可采用横向筛选方法。在每第十个切片或每条带中的一个切片上，手动创建具有高分辨率成像参数的成像区域并采集图像。检查图像，并在软件中标记包含ROI的切片，或做相应记录。
		<ol>
			<li>从包含ROI的切片出发，向前和向后浏览切片序列，并在结构仍可见的范围内，在相同相对位置创建高分辨率成像区域。此操作可手动完成，也可采用后续步骤中描述的程序。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对超过十个连续切片进行图像采集。按照操作手册所述，放大图像后点击开始位置优化，以提高已注册切片位置的精度。此操作可降低图像序列的位置变异性。该程序在补充材料第19-21页中有图示和说明。</li>
		<li>在任意切片上按住Alt键并点击拖拽以定义成像区域，然后在释放鼠标按钮后弹出的上下文菜单中选择创建瓦片集阵列（Create Tile Set Array）。软件将在之前已发现或标记的所有切片的相同相对位置自动创建成像区域。可通过切片范围（Section Span）滑块限制成像的切片范围。 
		注意：此程序可对任意数量的成像区域重复执行，从而允许在每个切片上记录多个小尺寸高分辨率图像，而非单个较大的图像。</li>
		<li>创建后，根据需要为每个图像序列设置像素数量、像素尺寸、瓦片布局、像素停留时间等参数。图像序列创建并配置完成后，将全部列于任务队列中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配置自动功能并启动图像采集
	<ol>
		<li>使用与前一步骤相同的方法，为自动功能创建独立的图像序列。将该图像序列移至切片上包含高对比度结构的位置。</li>
		<li>将图像序列设置为1024 x 884像素，并选择与前一步骤中设定的图像序列所用最高分辨率相对应的像素尺寸。在自动功能列表中，勾选自动聚焦和自动消像散。</li>
		<li>在采集序列控制中选择按切片（By Section），并确保自动功能图像位于列表首位。点击任务队列旁的运行按钮以启动图像采集。这些程序在补充材料第22-23页中有图示说明。 
		&#8203;注意：无需在每个切片上手动预先对焦。在记录过程中，每当显微镜前进至新切片时，系统将在该切片上所有其他图像采集前自动执行上述自动功能。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据比对与分析
<ol>
	<li>数据导出
	<ol>
		<li>确保数据以 .tif 格式保存，因此无需专用导出功能。将数据按与图层树中的图层和元素直接对应的文件夹结构进行分类整理。</li>
		<li>图像马赛克记录完成后，使用 StitchAll 功能自动拼接所有图块。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fiji 中的图像栈对齐与裁剪 
	&#8203;注意：许多软件包（免费和商业）可用于处理阵列断层成像数据。以下步骤使用开源程序 Fiji32&#160;进行演示，因其广泛可用且包含所有必需功能。
	<ol>
		<li>将一组图像（或已拼接的图像）作为虚拟栈导入 Fiji。</li>
		<li>若需标准化对比度/亮度，请从 Process 菜单中选择 Enhanced Contrast…。将 Saturated Pixels 设置为 0.1 或更低，并勾选 Process all Slices。</li>
		<li>从 Plugins 菜单中选择 Registration | Linear Stack Alignment with SIFT。</li>
		<li>在 Expected Transformation 下拉菜单中选择 Rigid 或 Affine 。其他参数保留默认设置。点击 OK 开始对齐。 
		注意：将数据作为虚拟栈加载可使 Fiji 处理任意大小的图像栈。对齐结果将在内存中生成；然而，这可能会限制可处理栈的最大尺寸。在此情况下，请使用 Register Virtual Stack Slices，该工具是对相同配准算法的文件夹到文件夹实现方式。配准完成后，将输出数据作为虚拟栈加载。</li>
		<li>点击 Crop 裁剪图像栈，使其仅包含感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>将图像栈保存为单个 .tif 图像或一系列 .tif 图像。 
		注意：阵列断层成像的关键步骤如 图 3 所示。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Luckner, M., Wanner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+light+microscopy+to+analytical+scanning+electron+microscopy+%28SEM%29+and+focused+ion+beam+%28FIB%29%2FSEM+in+biology%3A+Fixed+coordinates%2C+flat+embedding%2C+absolute+references%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references.</a> Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).</li>
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作者 Tilman Franke 是生产电子显微镜及本文所用试点项目的 Thermo Fisher 的员工。

电子显微镜可揭示细胞和生物体的超微结构，通常需要在三维环境中对目标结构进行成像以获得更深入的认识。尽管已有多种用于超微结构分析的电子显微镜技术，但仍缺乏一种 &#34;金标准&#34; 溶液。主要原因是样本种类繁多，生物学问题多样，通常需要定制化的处理方法。所提出的AT工作流程旨在最大限度地减少样本处理、数据采集、分析和存储所需的时间。此外，改进的刀具为简化阵列采集提供了有力工具。切片在晶圆上的紧凑排布方式，既便于观察，也便于后续样本的保存。这种布局方式使得 &#34;侧向筛选&#34; 通过在不同条带间水平移动并仅扫描每条带的一个切片，显著缩短了定位感兴趣区域（ROI）所需的时间。所提出的数据采集方案有助于靶向定位小而随机分布的区域。一旦发现目标区域，AT/SEM 即可将高分辨率成像精确限制在感兴趣的体积范围内，无论该过程是手动操作还是借助自动功能完成。对于有限体积的AT，可由操作者手动完成，通过导航样品并逐个定义成像区域。软件的自动化模块为在大切片上成像小区域提供了灵活的图像采集策略。该软件的自动化功能支持在数百个切片上记录大尺寸高分辨率图像，实现与SBFI相当的成像体积。对所有切片记录概览图像可简化ROI的定位，并减少显微镜操作时间。由于在获取概览图像及较高分辨率预览图像的过程中不会损伤切片，AT/SEM 允许重复使用样品以收集其他ROI的数据或进行更高分辨率的成像。
图像采集时间是三维电子显微镜（3D EM）中最重要（也是成本最高）的因素之一，因此应在实验设计阶段予以充分考虑。尽管大范围成像所需时间长于小范围成像并不令人意外，但人们往往容易低估其影响：根据所选成像参数的不同，每张切片的采集时间可能从数秒到数小时不等。关键的成像参数包括视场大小、分辨率和像素停留时间。假设目标分辨率为每像素10 nm，像素停留时间为1 µs，则成像20 µm × 20 µm、100 µm × 100 µm 或 500 µm × 500 µm 的视场分别需要4秒、100秒或2,500秒。可通过将每张切片的成像时间乘以切片总数，来估算完成整个成像任务所需的总时间。如果切片数量较少，或不考虑显微镜使用成本，则较长的单张切片成像时间是可以接受的。
然而，在大多数情况下，有必要将记录时间限制在过夜或周末完成的任务范围内。另一个同样关键的3D电镜（3D EM）问题，是所产生图像数据的数量和结构。对上述成像区域在100个切片中进行记录，将分别生成400 MB、10 GB或250 GB的图像数据；而500 µm × 500 µm的图像还存在单个文件超过2 GB的问题。许多用于数据处理的软件程序无法打开如此大尺寸的图像。
为了缩短成像时间，选择合适的像素驻留时间以满足后续数据评估（如重建、追踪）所需的信噪比，并将记录范围限制在定义的感兴趣区域（ROI），这一点至关重要。该软件的AT扩展功能支持在连续切片的小区域内进行图像采集。软件支持手动和自动工作流程，以及多种半自动模式：用户可手动在每张切片上定位和聚焦成像区域，也可使用自动切片查找和位置对齐功能。根据所选的自动化程度以及样本类型或成像目标的支持情况，在数百张切片中设置图像采集所需的时间可能长达一整天（手动操作）或仅需几分钟。原则上，与其他三维电子显微镜方法相比，阵列断层成像（Array Tomography）在获取小ROI图像时更具挑战性；连续切片上ROI定位不精确的问题必须通过采集更大的区域来补偿。例如，若ROI大小为20 µm × 20 µm，而相邻切片间成像区域的位置偏差为10 µm，则需要采集40 µm × 40 µm的图像，才能确保每个切片上的ROI在每幅图像中都被完整捕获。实际成像位置的偏差范围从100 µm到&#60;10 µm不等，具体取决于位置对齐软件功能的可用性或质量，以及操作者的耐心程度。使用该软件，在大多数样本中无需过多手动干预即可实现10 µm的定位精度。
与其他技术一样，AT 技术存在若干可能影响成功数据采集的薄弱环节，其中许多问题与其他基于切片的方法相似。树脂与组织分布不均可能导致切片条带弯曲或断裂。在极端情况下，切片可能从支撑膜上脱落（图6A）。切割过程中出现的压缩或拉伸不均可能导致折叠，进而在后续切片的不同区域破坏样本（图6B）。使用受损刀具时，收集的切片表面可能出现刀痕（图6C）。切片条件的差异可能引起偶尔的切片压缩以及厚度不一致。灰尘或杂质颗粒可能落在切片上，部分遮挡感兴趣区域（图6D）。图像采集可能因自动对比度、自动聚焦和自动消像散功能不完善而失败。自动创建的成像区域位置可能存在变异，可能无法在所有切片中完整捕获感兴趣区域（ROI）。
在拼接与对齐阶段可能会出现若干问题。自动拼接马赛克图块时可能失败，例如由于样品内部存在较大的空白区域。由于三维形态发生剧烈变化，图像堆栈的配准可能具有挑战性。专门开发的程序（如 IMOD、Fiji、TrackEM2、MIB 或 MAPS-AT）可辅助实现半自动对齐32,38,39,40。更具挑战性的部分可通过图像编辑软件进行手动对齐。遗憾的是，某些数据集可能无法实现正确对齐。
大样本在透射电镜连续切片中难以适配载网；另一方面，许多项目并不需要使用聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）或超薄切片扫描电镜（SBF-SEM）进行长时间的自动采集。阵列切片技术（AT）为繁琐的连续切片透射电镜提供了一种简便的替代方案，其在晶圆上收集和操作连续切片的过程比使用槽形载网更为简便。已有多种策略被开发用于促进切片阵列的收集，我们在此分享我们的方法，以扩展现有的技术工具集。在难以识别感兴趣区域（ROI）的情况下，AT-SEM具有显著优势，可高效地对样本进行筛选，实现跨50至500个切片、细胞器尺度分辨率的成像。对于更大的体积，若需要更多切片，也可高效地采用自动收集的AT策略。AT样本可多次重复成像，便于基于先前获取的概览图像对高分辨率区域进行靶向成像。我们认为，本文提出的AT/SEM靶向分析和减少过度采样的方法可降低工作量和数据存储需求。最终，切片文库可被收集并保存，供后续重复使用和查阅。对于体积成像，当感兴趣区域易于在块面识别或需要大体积三维数据进行分析时，FIB或SBF-SEM方法提供了极佳的解决方案。然而，当需要以靶向方式从特定感兴趣区域获取高分辨率图像堆栈时，FIB/SBF-SEM的效率较低。综上所述，本文提出的AT样本筛选方法及中等分辨率概览图像的使用，可将图像采集限制在切片阵列的相关区域，精确瞄准成像区域可加快数据获取速度并简化数据评估过程。
总之，尽管聚焦离子束-扫描电子显微镜（AT/SEM）的概念并非新颖，但其应用范围尚未达到其优势所应具备的普及程度。总体而言，该技术为其他现有的电镜方法提供了一种互补的手段。AT/SEM 与最广泛的样品制备方案和成像工作流程兼容，可在任何聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）或块面扫描电镜（SBF-SEM）设备上作为辅助技术实施。本文重点探讨了AT技术在获取那些难以通过其他方法成功处理的样品的超微结构数据方面的应用。我们希望，文中所述的便捷切片收集方法以及高度自动化的图像采集策略，能够帮助初次接触该技术的研究人员顺利开展工作，同时也有助于已有一定经验的使用者进一步优化该技术。

尽管电子显微镜（EM）相关技术具有重要意义，但掌握这些技术所需付出的努力使得该领域仍局限于少数专家之中。其中一个主要困难在于，如何在为电镜观察而保存的样品中识别并定位感兴趣的区域（Region of Interest, ROI）。同一样品在光学显微镜下观察与经过电镜制样处理后的外观存在显著差异。化学制备样品所经历的变化包括：脱水步骤后产生的各向异性收缩（每个维度约10%），以及在固定和染色过程中使用锇酸（osmium）导致荧光信号的丧失。图1A）。对于超薄切片，样品需采用不同方法包埋于环氧树脂或丙烯酸树脂中（图1B）。为获得理想的制备结果，必须将整个样品分割成不超过1 mm × 1 mm的片段。为了满足标准透射电子显微镜（TEM）观察条件的要求，还需将该微小样品进一步切成50–150 nm厚的超薄切片。所得灰度图像能够比其他任何显微技术更详细地展示整个样品中极小部分的组织结构和细胞器形态。图1C）。典型的透射电子显微镜（TEM）数据集提供二维信息，理论上需外推以理解细胞和组织三维空间中自然发生的过程。 图1D 提出了超微结构体积成像所面临的挑战：若将一个边长为1,000 µm的立方体以50 nm的厚度进行切片，需要20,000个切片才能覆盖整个体积；对于边长为500 µm的立方体，则需要10,000个切片；而要覆盖50 µm × 50 µm × 50 µm的体积，则需要1,000个切片 &#34;仅&#34; 可能是必要的。手动获取该体积几乎不可能，而通过自动化方式实现也极为困难。如果除了样本深度外，还需要覆盖此类假想立方体的整个表面，那么1 µm的覆盖范围2 以合理的分辨率获取表面信息成为一个严峻的后勤问题（图1E）。尽管对于连接组学等超大规模项目而言，大量的切片至关重要，但对于大多数 &#34;平凡的&#34; 在电子显微镜项目中，生成更多用于观察的切片会带来显著的劣势。
获取三维超微结构信息的方法有多种：连续切片透射电子显微镜（TEM）、TEM断层扫描、阵列断层扫描（AT）、连续块面成像扫描电子显微镜（SBF-SEM）以及聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）。这些方法之间的主要区别在于切片策略，以及图像采集是否与切片生成过程相耦合1。在连续切片TEM中，依次将切片收集到载网槽上，从这些序列中获取TEM图像并进行对齐2,3,4,5。在TEM断层扫描中，通过对载网上150–300 nm厚的切片进行倾斜系列成像，若结合连续切片，则可获得极高分辨率，但成像体积相对较小6,7,8。AT方法采用物理切片，并以多种手动或半自动方式将切片收集在较大支撑物上，例如玻璃盖玻片、硅晶圆或特殊胶带。在图像采集时，将该支撑物置于扫描电镜（SEM）中进行分析，可采用多种不同的图像采集策略9,10,11,12,13,14,15。对于SBF-SEM，切片通过安装在SEM腔室内的一台微型切片机和金刚石刀完成，SEM图像则来自树脂块表面16,17,18,19。对于FIB-SEM，离子源逐层去除样品表面的薄层，随后由SEM自动对暴露出的新表面进行成像20,21。TEM断层扫描和AT方法产生的是物理切片，必要时可重新成像，而SBF-SEM和FIB-SEM在成像后即消除切片。最近出现的一种结合多束SEM对物理切片进行成像的新方法，融合了多种技术优势，解决了图像采集速度的&#34;瓶颈&#34;问题22。这些技术中的每一种都革新了电镜数据的获取与分析方式，且每种方法在应对特定科研问题时均具有实际应用价值。
由于制备的性质以及超微结构尺度的限制，很难预测特定目标结构在样品块中的确切位置（图1D、E）。为实现感兴趣区域（ROI）的定位，一种解决方案是从一开始就以所需分辨率记录整个样品块的图像。这样可以在离开显微镜后于所获取的数据体积中查找目标结构。然而，该策略涉及的采集时间和数据处理量较大，存在实际困难。尤其当ROI远小于组织块时（例如目标对象为特定类型的细胞而非整个器官），减少记录数据量尤为必要。当荧光信号在样品制备前后得以保留并精确定位时，不同的相关光镜与电镜技术（CLEM）可取得成功23，24，25，26，27，28，29。然而，许多细胞结构即使在无荧光标记的情况下，仅凭已知的超微结构特征也可被识别。对于此类情况，我们认为横向筛选阵列断层成像技术在ROI定位所需投入与超微结构信息质量之间提供了良好的平衡。采用该策略时，可在硅片上按一定间隔规律性地筛选部分切片，筛选间隔可根据ROI的大小和特性确定。一旦发现ROI，即可设置连续切片的数据采集流程，从锚定切片之前开始，至其后结束，从而有针对性地获取相关信息。
我们提出了一种简化并加速获取多个切片中感兴趣区域或事件的连续切片电子显微镜（AT）操作流程，可生成更精确对齐的三维图像数据集。通过横向筛选和多步采集策略，可在精确靶向的区域内获得极高分辨率的数据。本文所述方法解决了三维电子显微镜（3D EM）数据采集中的多项挑战，具体包括：适用于多种类型的样品，且无需从根本上改变样品制备流程；实现切片与扫描电镜（SEM）成像的靶向定位；减少设置过程中的时间和操作负担；在多个切片中对目标区域进行成像，并实现更优的图像数据集对齐；以及通过平滑的拼接与对齐流程，将不同图像整合为一幅完整的拼接图。我们选择来自已发表及正在进行的研究项目的多个样本，以展示本方法的优势。我们认为，该方法可显著促进靶向电子显微镜数据的生成与采集，即使对于电子显微镜经验有限的研究人员亦具有良好的适用性。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;切片&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AT切片刀</td><td>Diatome</td><td>DUATS3530</td><td>Diatome Jumbo刀片</td></tr><tr><td>用于修整 90 的金刚石刀&amp;deg;</td><td>Diatome</td><td>DTB90</td><td>Diatome修块20&amp;deg;&lt;br/&gt; 玻璃刀</td></tr><tr><td>Pattex 接触胶水</td><td>Pattex</td><td>PCL3C</td><td></td></tr><tr><td>硅片</td><td>Ted Pella</td><td>16015</td><td>电阻：1–30 欧姆&lt;br/&gt; P型：（硼）（1个主定位面）&lt;br/&gt; 粗糙度：2 nm&lt;br/&gt; 无 SiO₂ 表面涂层&lt;br/&gt; TTV：= &amp;小于20 &amp;micro;m&lt;br/&gt; 晶圆一侧经过抛光</td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica UC6</td><td></td><td>替代方案：Leica UC7</td></tr><tr><td>晶圆切割工具包</td><td>电子显微术</td><td>7642</td><td>EMF，小型样本切割器，货号 7652</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;图像采集&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>场发射扫描电子显微镜</td><td>Thermo Fischer Helios</td><td>1072419</td><td>替代方案：Zeiss、Jeol、Hitachi、TESCAN</td></tr><tr><td>用于扫描电镜的 Correlative Workflow Maps 3 &amp;与阵列断层成像</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1135932</td><td>Maps 可实现 SEM 成像工作流程的自动化，并支持导入第三方数据用于 CLEM 及导航。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;&lt;strong&gt;图像分析&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amira x.y</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1131599</td><td>Amira 是一款用于 Array Tomography 数据重建的三维数据可视化与分析软件，具备多种实用功能。</td></tr><tr><td>图像处理</td><td>开源</td><td>Fiji（http://fiji.sc/#download）</td><td>IMOD，MIB（参考正文中的文献）</td></tr></tbody></table>

使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

Array Tomography Workflow for the Targeted Acquisition of Volume Information using Scanning Electron Microscopy

电子显微镜被广泛应用于生物学和医学领域，以纳米级分辨率对细胞及其结构细节进行成像。历史上，透射电子显微镜（TEM）为研究细胞超微结构提供了重要见解；然而在近十年中，现代扫描电子显微镜（SEM）的发展改变了我们观察细胞内部的方式。尽管在需要蛋白质水平结构细节时，TEM的分辨率更优，但对于大多数与细胞器水平相关的细胞生物学问题，SEM的分辨率已足够使用。技术的进步推动了自动体积成像方法的发展，例如连续块面成像（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）。然而直至今日，当目标区域的识别与精确定位至关重要时，这些方法仍效率低下。若缺乏在成像前精确定位目标区域的手段，操作者不得不采集远超实际所需的数据量（在SBF-SEM中），或者更糟的是，制备大量载网并逐一成像（在TEM中）。我们提出一种在SEM中利用阵列断层成像（Array Tomography）进行“横向筛选”的策略，可有效定位感兴趣区域，随后对样品总体积中的相关部分实施自动化成像。阵列断层成像样品在成像过程中得以保存，并可整理为切片文库，便于反复成像。本文展示了多个实例，表明通过横向筛选能够分析其他任何方法都极难获取的结构细节。

我们介绍了连续切片带的制备方法，以及将其收集在大型转移支撑材料上以用作阵列断层成像样本的流程，同时包括在扫描电子显微镜中进行自动成像的操作步骤。该方案可实现对局部稀有事件的筛选、定位与靶向成像，并支持大规模数据的采集。

电子显微镜在生物学和医学中用于以纳米级分辨率成像细胞和结构的细微细节。历史上，透射……

电子显微镜分析通常较为复杂。我们认为，本方案有助于对大样本表面及中间体积的电镜数据进行处理和采集。本方案有助于在连续切片中定位目标结构。数据记录仅限于必要的内容。与在整块组织中进行数据采集相比，记录时间缩短，数据分析也更为简便。鉴于该方法整体上的便捷性，我们认为它不仅可用于解答科学问题，还可作为诊断工具使用。为生成用于分析的切片阵列，首先将样品固定在超薄切片机的样品夹上，使用剃须刀片粗略修整样品周围的树脂。接着使用金刚石修块工具对样品进行精细修整，并使用倾斜角为20度或90度的修块刀，确保样品块的顶部和底部表面与刀刃的切割边缘平行。按3:1的比例混合二甲苯和胶水，用固定在牙签上的睫毛将混合物涂抹于修整后样品块的顶部和底部边缘。在混合物干燥的同时，使用晶圆切割工具将晶圆切割成适合分析的适当尺寸。晶圆干燥后，先用蒸馏水清洗以去除任何碎屑，再用等离子体清洁表面。准备阵列断层扫描刀时，使用泡沫胶带将一根针固定在组织学大型刀片的底部，然后将刀片以零度角度放入超薄切片机的刀架中。调整刀片边缘与包埋块表面平行，并将修整好的包埋块移至刀刃边缘，准备切片。将洁净的载网放入刀槽中，并向槽内加水至水位与刀刃齐平，然后使用附带的注射器酌情加水或吸水，使刀片的金刚石刃口充分润湿。进行阵列切片时，将切片机设置为切片厚度50至100纳米、切片速度6至1毫米/秒，开始切片，获得足够长的切带以覆盖目标Z轴体积。根据切块大小、组织的均一性以及树脂类型，切出的切带将大致呈直线状。使用干净且无粘性的睫毛尖端将切带从刀刃上轻轻剥离，并用睫毛轻轻将切带移至支撑介质的中央位置。必要时可使用氯仿或加热笔来展平切片。展平后，回抽注射器以开始排出水分。对于更精细的切带或需要更缓慢地排水时，可将注射器从软管上取下，使水自然滴落。当水位达到晶圆高度时，轻轻将带状物推至盆的中央，并继续排水，直至盆中所有剩余的水完全排尽。将晶圆置于洁净环境中自然干燥。干燥过程大约需要30分钟。当样品完全干燥后，将芯片转移至密闭盒中，以防灰尘污染。然后将盒子放入60°C的烘箱中至少30分钟。为获得显示晶圆上切片区位置的扫描电镜（SEM）图像概览图，可使用内置光学相机采集覆盖一排切片区域的SEM图像。要创建一幅拼接图像，请点击并拖动样本的相机图像，然后启动自动采集。以更高分辨率采集概览图像，以找到目标结构。如果仅需对少数几个区域进行成像，可使用可缩放查看器在原始位置查看已采集的图像。确定需要高分辨率成像的区域后，单击并拖动以创建成像区域，然后选择高分辨率成像设置，并将这些设置保存至模板。为查找特别微小或难以检测的稀有事件，可每隔10个切片或每条切片带中选择一个切片，应用高分辨率成像设置，手动创建成像区域并采集图像。随后查看所获取的图像，并标记出包含目标区域的切片。若需连续采集超过10个切片，可使用切片定位功能自动识别所有切片。如果概览图像未显示清晰的兴趣区域，则需对切片进行更高分辨率的成像，并使用切片预览功能自动创建并获取图像。为确定最佳成像参数，请在显微镜控制软件中启动实时成像，导航至一个兴趣区域，然后根据制造商的指南调整成像参数，直至图像显示出清晰的兴趣区域，同时避免过长的图像采集时间。为优化连续切片上成像区域的定位，请放大至目标图像，然后单击“开始位置优化”以提高已配准切片位置的精确度。要定义成像区域，请在按住 Alt 键的同时，单击并拖动任意切片上的某个区域，然后从弹出的上下文菜单中选择“创建平铺集阵列”。软件将在已找到或先前标记的所有切片中，于相同相对位置创建成像区域。然后根据需要为每个图像序列设置像素数、像素大小、平铺布局以及像素驻留时间。要配置自动功能，请如图所示为自动功能创建一个独立的图像序列，并将该图像序列移至包含高对比度结构的区域位置。将图像序列设置为 1024 x 884 像素，并选择与图像序列中使用的最高分辨率相对应的像素尺寸。在自动功能列表中，勾选自动聚焦（Auto focus）和自动消像散（Auto stigmator）。在采集序列控制中选择二分法，并确认自动功能的图像位于列表中的第一项，然后单击“全部采集”以开始图像采集。当所有成像序列均已创建并设置完毕后，这些序列将列在作业队列中。低分辨率采集可手动或自动执行，针对切片的选定部分或整个切片，采用单幅成像或马赛克成像，随后进行图像拼接。然后可以使用高分辨率参数获取所选区域的图像，以观察线粒体、细胞核和微绒毛等结构。在自动获取已解析的镶嵌图并选定后，可裁剪出多个感兴趣区域，或利用这些区域定义更精细的局部成像范围。尽管果蝇肠道中不同类型的特化细胞呈随机分布，但在使用高分辨率参数对单个切片或一系列连续图像进行筛选后，这些细胞可被直观区分。完成图像对齐后，图像堆栈可通过多种软件方案进行三维重建与渲染。阵列断层分析技术可以在单个晶圆上生成多个连续切片，并使用低分辨率参数进行筛选，以定位感兴趣的大概区域。这些区域可被靶向用于进一步的高级采集参数分析。例如，由于细胞相对于分裂区较大，在超微结构水平上定位胸片区域的有丝分裂较为困难。然而，利用该方法，可通过 20 到 40 个切片的中等分辨率自动概览图像来定位分裂细胞。阵列断层扫描技术提供了更为直接的电子显微镜数据分析流程。我们鼓励研究者投入时间掌握再生技术，并熟悉与图谱相关的操作流程。根据我们的经验，很少有研究课题需要对整个动物或完整器官进行超微结构分析。我们的方法有助于快速定位组织中的细胞及其相互作用伙伴。

array-tomography-workflow-for-targeted-acquisition-volume-information

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

阵列断层扫描工作流程，用于使用扫描电子显微镜有针对性地采集体积信息

我们介绍了一种利用高通量冷冻电子断层扫描技术测定高分辨率结构的实验方案 原位...

使用 Tomoauto：高通量自动化冷冻电子断层成像实验方案

本报告描述了一种用于对厚生物样品进行扫描透射电子断层成像的样品制备方案及特定成像条件。...

通过扫描透射电子断层成像技术制备与观察厚生物样品

本文介绍了一种高效结合连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜的技术方案，用于定位目标区域。该方法可在大视野范围内实现三维空间中稀有事件的高效搜索与精确定位。...

利用连续块面扫描与聚焦离子束扫描电子显微镜进行的靶向研究

低温电子断层扫描中对大规模数据采集日益增长的需求，要求具备高通量的成像采集流程。本文所述方案实现了先进的采集策略的最新进展，旨在最大限度地提高断层扫描数据采集的时间效率和通量。...

冷冻电子断层扫描数据采集优化策略

本方案介绍了一种在结构保持完整的染色质中对复制位点进行高分辨率定位的技术 原位...

通过电子断层扫描技术在超微结构保存的染色质中成像复制结构域

本实验方案描述了使用 Tomo5 进行高分辨率冷冻电子断层扫描远程数据采集，以及使用 emClarity 进行后续数据处理和子断层平均化的方法。以脱铁铁蛋白为例，详细展示了获得分辨率为 2.86 Å...

冷冻电子断层扫描远程数据采集与亚断层图像平均法

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

有孔肝窦状内皮细胞是一种重要的生物学滤过系统，其结构易受多种疾病、毒素及生理状态的影响。这些变化显著影响肝脏功能。本文描述了对该类细胞中孔径大小和孔数量进行测量的标准化方法。...

利用扫描电子显微镜分析肝窦内皮细胞及其窗孔的标准化方法

学习阵列断层扫描工作流程，利用扫描电子显微镜采集体积信息。该方法通过制备连续超薄切片，实现大样本中稀有目标结构的高效定位与成像，显著缩短数据采集时间并简化分析流程。

使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

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