Name: 方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习使用负染透射电子显微镜可视化外周膜蛋白与纳米盘膜的结合过程。该方法通过观察纳米盘堆叠模式的改变来研究蛋白质-膜相互作用，为药物筛选和高分辨率结构测定提供重要基础。

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作者感谢瑞典研究理事会、斯德哥尔摩县议会以及卡罗林斯卡学院基金的支持。MSP 的表达与纯化工作在卡罗林斯卡学院/SciLifeLab 蛋白质科学核心设施（http://PSF.ki.se）完成。作者还要感谢 Pasi Purhonen 博士和 Mathilda Sjöberg 博士分享其技术专长并提供及时的帮助。

1. 纳米盘的制备
<ol>
	<li>膜支架蛋白的表达与纯化8,35
	<ol>
		<li>表达带有 His 标签的 MSP1E3D1 蛋白 E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 菌株培养于锥形瓶中。使用添加50 µg/mL 卡那霉素的LB培养基，于37 °C培养50 mL过夜种子液。将过夜种子液接种至2 L添加50 µg/mL卡那霉素的优质肉汤（terrific broth）培养基中进行稀释培养。</li>
		<li>在37 °C下培养细胞，直至600 nm处的光密度（OD600）达到约3时，在18 °C下用0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达3小时。</li>
		<li>制备裂解缓冲液（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；100 mM NaCl；10% 甘油）。使用前立即加入 1 mM TCEP。</li>
		<li>在18 °C诱导3小时后，于4,500 × g离心10分钟（4 °C）收集细胞。弃上清液，称量收集的细胞，并按每克细胞加入2 mL裂解缓冲液的比例将细胞重悬于裂解缓冲液中。</li>
		<li>采用脉冲超声处理裂解细胞（工作周期：开启4秒，关闭4秒），在80%振幅下持续3分钟。</li>
		<li>在 49,000 × g 和 4 °C 条件下离心裂解液 20 分钟，弃去离心沉淀。</li>
		<li>将上清液注入5 mL Ni柱+ 与自动液体色谱系统相连的螯合柱，建议在4 °C下保存。</li>
		<li>在洗脱步骤（步骤 1.1.9）之前，用以下缓冲液 1 - 3 洗柱，以去除除 His 标签 MSP 以外的所有蛋白质。在 280 nm 处监测蛋白含量以追踪纯化过程；每次洗涤后，280 nm 处的紫外吸收值应恢复至基线水平。
		<ol>
			<li>用洗涤缓冲液1洗涤：40 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mM 咪唑和1% Triton，pH 8.0。</li>
			<li>用洗涤缓冲液2洗涤：40 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、20 mM 咪唑和50 mM 胆酸钠，pH 8.0。</li>
			<li>用洗涤缓冲液3洗涤：40 mM Tris-HCl、300 mM NaCl和50 mM 咪唑，pH 8.0。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用含40 mM Tris-HCl、300 mM NaCl和500 mM咪唑、pH 8.0的缓冲液洗脱MSP。</li>
		<li>通过凝胶过滤将缓冲液更换为MSP标准缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；100 mM NaCl；0.5 mM EDTA）8,35；每批产量应约为 7 mg/L-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磷脂储备液的制备
	<ol>
		<li>加入305 µL的1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（POPC）溶于氯仿，浓度为25 mg/mL，置于玻璃烧杯中，用温和的氮气流吹扫以蒸发氯仿。将脂质在真空干燥器中过夜干燥。注意：此步骤旨在去除脂质中的溶剂，从而在玻璃烧杯底部形成一层均匀的脂质薄膜。</li>
		<li>将脂质沉淀物重悬于200 µL含有100 mM牛磺胆酸钠的MSP标准缓冲液中，通过涡旋振荡离心管直至溶液变为透明；此步骤将获得浓度为50 mM的POPC溶液。 
		注意：通常情况下，此时脂质与去垢剂的摩尔比应为 1:2（脂质:去垢剂）8该脂质-去垢剂混合物可在 -80 °C 下保存近 2 个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于去垢剂去除的疏水珠的制备
	<ol>
		<li>将5 g（干重）珠子置于50 mL离心管中。</li>
		<li>用30 mL 100%甲醇洗涤磁珠，随后用40 mL超纯水洗涤。</li>
		<li>用10 mL MSP标准缓冲液洗涤磁珠。最后，将磁珠悬浮于15 mL MSP标准缓冲液中，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米盘重组
	<ol>
		<li>将190 µL的MSP1E3D1（0.124 mM）加入微量离心管中，再向同一管中加入61.5 µL磷脂储备液（50 mM POPC）。将重组混合物置于湿冰上孵育1小时。注意：此比例相当于摩尔比1:130（MSP1E3D1:POPC）。</li>
		<li>加入疏水珠，每毫升重建混合物中加入0.5 g珠子，以启动自组装过程。在4 °C下于旋转孵育器中孵育16小时。</li>
		<li>孵育后，在 13,000 x g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，以去除沉淀物和聚集体。弃去沉淀，保留上清液。</li>
		<li>将尺寸排阻色谱柱（安装在自动液体色谱系统上）用MSP标准缓冲液平衡，直至280 nm处的吸光度稳定。将上清液注入色谱柱，并收集峰馏分。</li>
		<li>在280 nm处测定洗脱峰组分中纳米盘的浓度。使用MSP1E3D1的摩尔消光系数（ε = 29,910 cm⁻¹·M⁻¹）进行计算。-1 M-1用于计算纳米盘浓度。注意：每个纳米盘中的脂质数量可通过放射性标记脂质与磷酸盐分析相结合的方法测定。4 或仅通过磷酸盐分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 单向膜蛋白5-脂氧合酶的制备35
<ol>
	<li>准备过夜培养的起始菌液。在50 mL LB培养基中添加100 µg/mL氨苄青霉素，接种含有5-脂氧合酶基因（ALOX5）质粒的E. coli BL21 (DE3)菌株。将过夜培养的菌液按比例接种至表达培养基中，表达培养基组分为：42 mM Na2HPO4、24 mM KH2PO4、9 mM NaCl、19 mM NH4Cl、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、0.2% D-葡萄糖、0.1%（v/v）甘油、5 µM FeSO4以及100 µg/mL氨苄青霉素。在25 °C下培养至OD600约为0.5，随后加入0.2 mM IPTG，在20 °C诱导蛋白表达16小时35。</li>
	<li>在7,000 × g、4 °C条件下离心10分钟收集菌体，弃去上清液。称量收集的菌体沉淀，并按照每克菌体加入2 mL裂解缓冲液的比例，将菌体重悬于含蛋白酶抑制剂和0.5 mg/mL35溶菌酶的裂解缓冲液中（100 mM Tris-HCl，pH 8.0；100 mM NaCl；10%甘油；1 mM TCEP）。</li>
	<li>采用超声破碎法裂解细胞，设置为80%振幅，每次15秒，共5次。在7,000 × g、4 °C条件下离心10分钟去除细胞碎片。向溶液中加入硫酸铵至30–60%饱和度，使蛋白质沉淀35。在16,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。注：5-脂氧合酶（5LO）沉淀可迅速冷冻并在-80 °C保存长达6个月。</li>
	<li>用20 mL裂解缓冲液重悬沉淀，并在40,000 × g、4 °C条件下离心15分钟。</li>
	<li>将上清液于4 °C下在ATP琼脂糖柱上孵育30分钟。用一柱体积含0.5 M NaCl的裂解缓冲液洗涤柱子一次。使用含10 µM FeSO4和20 µg/mL过氧化氢酶的裂解缓冲液配制20 mM ATP溶液洗脱5LO。进行凝胶过滤层析以去除ATP35。 
	注：5LO蛋白不稳定，纯化后应立即使用。否则，建议在硫酸铵沉淀步骤暂停（参见步骤2.1.3后的注释）。</li>
</ol>
3. 纳米盘-蛋白复合物的制备
<ol>
	<li>制备总体积为 100 µL 的复合物。在含有 1 mM Ca2+ 的 MSP 标准缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5；100 mM NaCl；0.5 mM EDTA；和 1.5 mM CaCl2）中，混合 0.8 µM ND 与 0.8 µM 5LO，并在冰上孵育 10 分钟。注意：样品可在 4 °C 下保存长达一个月35。</li>
</ol>
4. 样品分析
<ol>
	<li>凝胶电泳
	<ol>
		<li>非变性电泳
		<ol>
			<li>将15 µL样品与5 µL上样缓冲液（50 mM BisTris、6 N HCl、50 mM NaCl、10% (w/v) 甘油和0.001% 亮蓝G-250，pH 7.2）49混合，加样至4 - 16% Bis-Tris凝胶中进行电泳。</li>
			<li>用轻阴极缓冲液（50 mM BisTris；50 mM Tricine，pH 6.8；0.002% 考马斯亮蓝G-250）填充阴极槽，用运行缓冲液（50 mM BisTris和50 mM Tricine，pH 6.8）填充阳极槽。以150 V恒定电压开始分离。</li>
			<li>当考马斯亮蓝前沿迁移至凝胶末端时，停止电泳分离。</li>
			<li>采用标准考马斯亮蓝染色方法对凝胶进行染色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>变性电泳
		<ol>
			<li>将40 µL样品与10 µL含SDS的上样缓冲液（0.05% (w/v) 溴酚蓝；0.2 M Tris-HCl，pH 6.8；20% (v/v) 甘油；10% (w/v) SDS；10 mM 2-巯基乙醇）混合，加样至4 - 20% Tris-甘氨酸凝胶中进行电泳。</li>
			<li>用运行缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 6.8；200 mM 甘氨酸；0.1% (w/v) SDS）填充阴极和阳极槽。以150 V恒定电压开始分离。</li>
			<li>当上样染料前沿迁移至凝胶末端时，停止电泳分离。</li>
			<li>采用标准考马斯亮蓝染色方法对凝胶进行染色。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NaPT溶液的制备
	<ol>
		<li>在室温下通过搅拌将1 g磷钨酸钠盐溶解于50 mL水中，得到2% (w/v) 的酸性溶液。</li>
		<li>用1 M NaOH将pH调节至7.4。使用0.22 µm针头滤器去除颗粒。溶液可在室温或4 °C下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）分析样品的制备
	<ol>
		<li>将碳支持铜网（400目）在30 mA条件下辉光放电20秒，以使铜网表面亲水，便于样品吸附。取3.5 µL样品（相对于纳米盘浓度为0.8 µM）滴加于铜网上，孵育30秒。注意：加样体积可根据样品浓度在2.5至5 µL之间调整。纳米盘的适宜浓度范围为0.5 - 1 µM。</li>
		<li>用滤纸吸去多余液体。</li>
		<li>立即用一滴2% NaPT染色30秒。吸去多余染液后，将铜网置于空气中自然干燥。</li>
		<li>通过TEM观察铜网。使用加速电压为120-200 keV的透射电子显微镜即可评估堆叠程度。注意：本实验方案中使用了一台经校准的透射电子显微镜，配备200 keV场发射枪。</li>
		<li>记录TEM图像。对于显示长串堆叠的图像，无需进一步处理；图像显示的是纳米盘复合物，其中外源蛋白可能包含少量短堆叠，但大多数颗粒处于复合状态。记录多张图像，并按照标准方法进行处理，以获得分类平均图像及该复合物的低分辨率三维结构模型。 
		注意：负染数据采集时，铜网分别在至少三个不同日期制备。每天均在施加负染前重新进行新鲜样品孵育（如步骤3.1所述）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法可分为三个部分：空纳米盘的重建、蛋白质-纳米盘复合物的制备，以及这些复合物用于透射电子显微镜观察的负染色。以下将分别针对该技术的局限性、关键步骤和有用的改进方法进行阐述。
空纳米盘的重建。纳米盘制备与使用过程中的关键步骤及局限性。
在制备空纳米盘时，优化膜支架蛋白（MSP）与脂质的比例至关重要。对于最常见的MSP和脂质（使用胆酸盐作为去垢剂），文献中已有针对最佳比例的建议例如， 每分子MSP1E3D1含有125至130个POPC分子8,51 在本方案中使用）。与已发表比例的差异可能取决于蛋白质浓度测定方法、脂质在去垢剂中溶解的效率，以及从溶液中去除去垢剂的方法。
我们建议使用疏水珠进行去垢剂去除48（步骤1.3），可能的替代方法包括透析或添加环糊精52</...

在医学研究中，人们广泛关注参与多种脂质相互作用的膜蛋白，无论是内在膜蛋白还是外在膜蛋白。研究脂质相互作用蛋白时，通常需要选择脂质的替代物，例如去垢剂、两亲聚合物（amphipols）1 或小分子蛋白2，或者寻找能够保持蛋白可溶性和活性的膜替代系统。脂质膜替代物包括脂质体和纳米盘（nanodiscs, ND）3,4。
Nanodiscs 是通过改造天然存在于血液中的高密度脂蛋白（HDL）的蛋白质组分 ApoA-1 而构建的近天然膜平台。ApoA-1 是一条由多个短两亲性 α-螺旋组成的 243 个残基长的肽链，具有无脂状态下的可溶性构象。体外条件下，当存在脂质时，两分子 ApoA-1 蛋白会自发重排，环绕在脂双层片段的疏水酰基链区域5。经过工程化改造的 ApoA-1 通常被称为膜支架蛋白（MSP），目前已有多种不同类型的 MSP 以质粒或纯化蛋白的形式商业化供应。通过在 ApoA-1 中重复或删除 α-螺旋结构，可以获得更长6或更短7的膜支架蛋白，从而能够形成直径约 6 nm7 至 17 nm8 的 Nanodiscs。Nanodiscs 具有多种应用类型3,9，其中最常用的是为整合膜蛋白提供一个近天然的膜环境以实现其稳定8，相关应用已有综述3,9。另一种较少被探索的应用是为外周膜蛋白的研究提供纳米尺度的膜表面10,11,12,13,14,15,16,17。以下方案的第 1 节展示了由磷脂和膜支架蛋白制备 Nanodiscs 的操作流程。
样品制备是大多数方法中的瓶颈。特定于某种方法的样品可能提供特殊信息，但也使得结果之间的比较变得困难。因此，若样品具有多模态性，可直接用于多种不同方法，则更为简便。使用纳米盘（nanodisc）的一个优势在于其尺寸较小，相较于脂质体（例如，样品可直接用于透射电子显微镜和非变性凝胶电泳，如本实验方案所示）。
囊泡和脂质体长期以来被用于研究膜相互作用蛋白的功能。在结构研究和可视化方面，已有在脂质体中测定跨膜蛋白结构的实例18。然而，据我们所知，目前尚未发表任何嵌入脂质体膜上的单次跨膜蛋白的高分辨率三维结构。可使用金纳米颗粒或抗体通过透射电子显微镜（TEM）来观察蛋白质与脂质体或囊泡的结合19。尽管这些探针具有很高的特异性，但它们可能会通过遮蔽膜结合位点或利用其柔性部分掩盖感兴趣区域而干扰膜结合蛋白的功能。标记金颗粒或形成抗体复合物的蛋白质或许可在凝胶上进行分析，但这会增加实验成本。
尽管脂质体是一种优良的平台，但无法确定其群体中每个脂质体所含蛋白质的特定比例，而这一特性可通过使用纳米盘进行研究20。在脂质体中，辅因子和底物可被包裹在其可溶性内部空间中。对于膜可溶性物质，其在两种膜模拟物中的分布情况相同。然而，由于纳米盘的双层膜面积较小，因此需要更少的物质即可使纳米盘膜达到饱和。
通过确定蛋白质的原子结构来理解其功能，对许多研究领域都至关重要。蛋白质结构测定的方法包括X射线21、核磁共振（NMR）22,23以及低温电子显微镜（cryoEM）技术，后者是在低温条件下进行的透射电子显微镜（TEM）24。近年来，cryoEM的分辨率显著提高，主要得益于直接电子探测器的应用25,26。大分子在薄层玻璃态冰中以接近天然的状态被成像27。然而，由于生物分子的对比度较低，在100–200 kDa大小范围内的分子难以被检测。对于尺寸合适的样品，可以进行数据采集，并采用单颗粒重构方法获得结构信息28。
然而，通过透射电子显微镜（TEM）测定蛋白质结构是一个多步骤的过程。该过程通常首先使用负染色TEM技术评估样品的单分散性29，所用染色剂为磷钨酸（PT）30或铀盐等重金属盐31。通常可基于负染色的大分子重建出低分辨率模型，从而获得有关分子结构的重要信息29。与此同时，可开始进行冷冻电镜（cryoEM）的数据采集。在分析负染色TEM数据时应格外谨慎，以避免对人工假象的误判。其中一种特定的假象是PT染色剂对磷脂和脂质体的作用32，导致形成类似从侧面观察时呈硬币堆叠状的长棒结构33。此类“串珠状”结构或“堆叠”结构（下文统称为“堆叠”）最早在高密度脂蛋白（HDL）中被观察到34，随后也在纳米盘（nanodiscs）中发现35。
膜的堆叠与重塑可能由多种原因引起。例如，铜离子可诱导该现象，通过磷钨酸钠染色后的透射电子显微镜（TEM）成像已观察到这一点36。在脂质体中，部分膜脂含有亚氨二乙酸头部基团，可模拟EDTA对金属离子的络合作用，因此在加入铜离子后导致脂质体发生堆叠36。堆叠也可能由脂双层内或其表面的蛋白质之间的相互作用引起（相关研究未提及所用染色剂）37。早期已观察到PT诱导磷脂形成堆叠结构，但后续研究则集中于消除或抑制此类人工假象的产生38。
本文提出一种利用磷钨酸钠（NaPT）诱导纳米盘堆叠的方法，以通过透射电子显微镜（TEM）研究膜结合蛋白。简言之，当蛋白结合到纳米盘上时，会阻止纳米盘之间的堆叠。尽管堆叠的具体机制尚不明确，但已有研究39提出，磷脂与磷钨酸根（PT）的磷酸基团之间存在静电相互作用，导致纳米盘相互粘附（图1A）。本实验方案的假设是：当蛋白结合至纳米盘后，由于蛋白的空间位阻效应，大部分磷脂表面无法与PT发生相互作用，从而抑制堆叠的形成（图1B）。由此可得出两点结论：第一，堆叠现象的抑制表明目标蛋白已结合至膜上；第二，所形成的蛋白-纳米盘复合物可通过标准的单颗粒处理方法24,40进行分析，以获得复合物的粗略形貌结构。此外，还可采用非变性凝胶电泳或动态光散射等方法对样品进行进一步分析。
为了验证这一假设，我们采用了膜结合蛋白5-脂氧合酶（5LO），该蛋白参与多种炎症性疾病41,42。这种78-kDa的蛋白需要钙离子才能与其膜结合43。尽管已有大量研究利用脂质体44,45,46和膜组分47对这种膜结合作用进行了研究，但这些体系无法用于透射电子显微镜（TEM）分析和结构测定。
纳米盘的制备始于将MSP与溶解在去垢剂胆酸钠中的脂质混合。在冰上孵育1小时后，使用吸附性树脂从重组混合物中缓慢去除去垢剂。这类材料通常由聚苯乙烯制成的小珠构成，具有相对较强的疏水性，且与脂质相比更倾向于结合去垢剂。48去除疏水珠并经离心澄清后，通过尺寸排阻色谱（SEC）纯化纳米盘。将纯化的纳米盘与单次跨膜膜蛋白（及可能的辅助因子）按等摩尔比例（或多个比例用于滴定）混合，反应15分钟。透射电子显微镜（TEM）分析通过施加样品进行 &#181;将样品以微升级别点样至经辉光放电处理的碳膜载网上，随后使用磷钨酸钠（NaPT）进行负染色。用于点样至透射电镜载网的同一份样品，亦可用于非变性或SDS-PAGE凝胶电泳分析，以及各类活性测定，且无需进行重大调整。

<table><tbody><tr><td>透射电子显微镜：JEOL2100F</td><td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD相机</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH，德国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电晕放电器</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透射电镜载网：400目</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>尺寸排阻色谱柱：Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>质粒：MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>细菌：BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>细菌：BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纯化介质：ATP琼脂糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>纯化介质：HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>脂质：POPC</td><td>Avanti polar lipids</td><td>850457C</td><td>氯仿中浓度为25 mg/mL</td></tr><tr><td>疏水珠：Bio-Beads，SM-2树脂</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>13 mm注射器滤器：0.2 &amp;mu;m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>染色剂：三碱基钨酸钠水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>去垢剂：胆酸钠水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>胆酸钠</td><td></td><td></td><td>500 mM 胆酸钠。用超纯水重悬后，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>脂质储备液</td><td></td><td></td><td>50 mM POPC，100 mM 胆酸钠，20 mM Tris-HCl（pH 7.5），100 mM NaCl。&lt;br /&gt;氮气吹扫后，4 &amp;deg;C 可保存一周；或&lt;br/&gt; -80 &amp;deg;C 可保存一个月。</td></tr><tr><td>MSP标准缓冲液</td><td></td><td></td><td>20 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，0.5 mM EDTA。&lt;br /&gt;4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>非变性电泳阳极缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8</td></tr><tr><td>非变性电泳阴极缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris，50 mM Tricine，pH 6.8，0.002% 考马斯亮蓝G-250</td></tr><tr><td>非变性电泳4倍上样缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris，pH 7.2，6 N HCl，50 mM NaCl，10% (w/v) 甘油，0.001% 丽春红S</td></tr><tr><td>变性电泳运行缓冲液</td><td></td><td></td><td>实验室配方：25 mM Tris-HCl，pH 6.8，200 mM 甘氨酸，0.1% (w/v) SDS</td></tr><tr><td>变性电泳5倍上样缓冲液</td><td></td><td></td><td>实验室配方：0.05% (w/v) 溴酚蓝，0.2 M Tris-HCl，pH 6.8，20% (v/v) 甘油，10% (w/v) SDS，10 mM 2-巯基乙醇</td></tr><tr><td>优质肉汤培养基（Terrific broth）</td><td></td><td></td><td>胰蛋白胨 - 12.0 g，酵母提取物 - 24.0 g，100 mL 0.17 M KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 0.72 M K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，甘油 - 4 mL。&lt;br /&gt;胰蛋白胨、酵母提取物和甘油加至900 mL，分别灭菌。KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 分别配制并单独灭菌。使用前将两者混合。</td></tr></tbody></table>

通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

单次跨膜蛋白在结合到膜表面时发挥其功能，此类相互作用依赖于特定的脂质组成以及具有足够空间以执行功能。纳米盘（nanodiscs）可用于提供具有可控尺寸和脂质成分的膜表面。在没有结合外周蛋白的情况下，经磷钨酸钠染色的纳米盘在透射电子显微镜（TEM）下从侧面观察时呈现为类似硬币堆叠的形态。因此，本实验方案旨在有意促进这种堆叠现象；相应地，若观察到堆叠被抑制，则可解释为膜结合蛋白已结合至纳米盘上。进一步地，可通过标准的单颗粒分析方法对蛋白-纳米盘复合物的TEM图像进行处理，获得低分辨率结构，为后续高分辨率冷冻电镜（cryoEM）研究提供基础。此外，纳米盘所提供的样品适用于透射电镜分析或非变性凝胶电泳。为演示该方法，本文展示了钙离子（Ca2+）诱导的5-脂氧合酶在纳米盘上的结合过程。

我们提出的方法依赖于制备纳米盘，以提供单向膜蛋白结合的膜表面。由于纳米盘的脂双层中未嵌入跨膜蛋白，因此这些纳米盘被称为“空纳米盘”（图2A）。其组成为两个MSP1E3D1支架蛋白和约260个POPC分子，计算分子量为256 kDa8。采用该蛋白:脂质比例进行重组，在凝胶过滤过程中仅洗脱出一个主峰（图2A）。对洗脱体积约为9 mL的峰组分（图2A）进行蓝色天然凝胶电泳分析49，结果显示仅有一条条带（图2B，泳道1）。尽管该条带对应的分子大小略大于计算值256 kDa，但在透射电子显微镜（TEM）图像中测得的纳米盘直径与预期的13 nm ± 0.5 nm相符。
单次跨膜蛋白5-脂氧合酶（5LO）的纯化步骤如上文所述（方案步骤2）...

许多蛋白质在结合到膜表面时发挥其功能。通过透射电子显微镜可间接观察外周蛋白与纳米盘膜的结合。我们发现，负染剂磷钨酸钠诱导纳米盘形成特征性堆叠（缗钱状结构）的现象，会因外周蛋白的结合而受到抑制。

单次跨膜蛋白在附着于膜表面时发挥其功能，此类相互作用依赖于特定的脂质组成以及……

本实验的总体目标是通过负染色透射电子显微镜技术，观察外周膜蛋白在纳米盘膜表面的结合情况，作为该蛋白高分辨率结构解析的第一步。该方法有助于回答多个研究领域中的关键科学问题，因其涉及发生在细胞膜内及膜上的蛋白质功能活动。该技术的主要优势在于，当蛋白无法与膜结合时，会形成特征性的纳米盘堆叠结构。这些堆叠结构可通过透射电子显微镜清晰观察到。该技术的应用意义延伸至药物开发领域，因为可以方便地筛选化合物是否具有阻断或促进膜蛋白相互作用的能力。尽管该方法可为单向结合蛋白与膜结合的最佳条件提供见解，但它也能提供蛋白纳米盘复合物的低分辨率结构信息。开始实验前，首先表达并纯化膜支架蛋白（如 MSP1E3D1）。接着，使用带金属针头的玻璃注射器，将 305 微升浓度为 25 毫克/毫升的氯仿溶解 POPC 加入一个玻璃圆底烧瓶中。在通风橱内，用温和的氮气流蒸发氯仿。将剩余的脂质在真空干燥器中过夜干燥。然后用200 µL含有100 mM胆酸钠作为去垢剂的MSP标准缓冲液溶解干燥的脂质饼。涡旋混合物至透明，得到缓冲液中50 mM POPC的悬浮液。接下来，用30毫升100%甲醇洗涤5克疏水性珠子，再用40毫升超纯水洗涤，最后用10毫升MSP标准缓冲液洗涤。将珠子保存在15毫升标准缓冲液中，置于4摄氏度下。然后，将190微升0.124毫摩尔的MSP1E3D1溶液与61.5微升50毫摩尔的POPC悬浮液在缓冲液中混合，得到MSP与POPC摩尔比为1:130，胆酸钠浓度为25毫摩尔。每种脂质类型和MSP类型组合下的脂质与MSP的最优比例各不相同，必须进行优化以获得均一的纳米盘制剂。将混合物在湿冰上孵育一小时。然后将溶液加入含有每毫升重构混合物体积对应0.5克洗涤过的疏水豆的离心管中，以启动纳米盘的自组装。将混合物在4 °C、7~8 转/分钟条件下孵育16小时。孵育结束后，静置使磁珠自然沉降。移除上清液并置于4 °C保存，待进行凝胶过滤层析时使用。在进行凝胶过滤色谱之前，将混合物在4摄氏度下以13,000 g离心10分钟。倾出上清液，弃去沉淀物。用MSP标准缓冲液平衡凝胶过滤色谱柱，直至280纳米处的基线稳定。将上清液注入层析柱，并以0.5毫升的组分收集产物。使用紫外-可见分光光度计在280纳米处测定各组分的吸光度。根据所选膜支架蛋白（MSP）的摩尔消光系数计算纳米盘的浓度。进行非变性凝胶电泳时，首先将15微升样品与5微升适当的上样缓冲液混合。用轻阴极缓冲液填充阴极槽，用运行缓冲液填充阳极槽。将样品上样至4%–16% Bis-Tris凝胶，并开始电泳。根据凝胶生产商的说明书对凝胶进行染色。为了开始制备含有五种脂氧合酶作为蛋白质的纳米盘单向蛋白复合物，需配制一批含有1.5毫摩尔氯化钙的MSP标准缓冲液。表达并纯化5LO蛋白。立即在钙离子富集的MSP标准缓冲液中配制100微升含0.8微摩尔5-脂氧合酶（5LO）和0.8微摩尔纳米盘的混合液。以我们的单向整合膜蛋白酶5-脂氧合酶为例，其结合膜的能力依赖于钙离子浓度。5LO具有高度敏感性，必须在配制后数小时内使用。将混合物在冰上孵育10分钟。将所得的纳米盘蛋白复合物样品在4摄氏度下保存，最长可保存一个月。开始透射电子显微镜（TEM）分析前的准备时，在室温下将1克磷钨酸钠盐溶解于50毫升超纯水中。用1摩尔氢氧化钠溶液将溶液pH值调节至7.4。将磷钨酸钠溶液经0.22微米注射器滤器过滤，室温保存。随后，对400目碳膜铜网进行辉光放电处理，电流30毫安，持续20秒，以使网格表面具有亲水性。取 2.5 至 5 微升纳米盘单拓扑蛋白复合物样品滴加至载网上，静置 30 秒。随后用滤纸吸去载网上的多余溶液。立即滴加一滴磷钨酸钠溶液，并让溶液静置 30 秒。吸去多余溶液，使载网自然晾干。使用120至200千伏的加速电压进行透射电子显微镜观察。在后续图像处理中排除显示长串叠层的图像。对于所选图像，采用标准处理方法确定纳米盘单拓扑蛋白的类别平均图像，并生成其低分辨率三维模型。通过该方法，以膜支架蛋白与脂质1:130的比例制备了空纳米盘。在尺寸排阻色谱中仅观察到一个主要峰，蓝色天然凝胶电泳中也仅观察到一条条带。当空的纳米盘与磷钨酸钠盐溶液处理时，会诱导产生堆叠结构。这些长串的堆叠结构可通过透射电子显微镜（TEM）观察到。在加入磷钨酸钠溶液前，纳米盘溶液中添加钙离子并不会破坏这种堆叠现象。当五脂氧合酶等单拓扑结构蛋白结合到纳米盘表面时，蛋白的空间位阻会阻碍纳米盘的堆叠。纳米盘的两侧均可用于结合，从而形成一比一和二比一的5LO-纳米盘复合物。二比一5LO-纳米盘复合物样品的堆叠程度低于一比一的样品。5LO 的结合需要钙离子的存在。这一点通过观察不含钙离子的 5LO 与纳米盘混合物中出现的堆积现象得以证实，表明 5LO 未结合到膜表面。一旦单向整合蛋白和纳米盘制备完成，若操作得当，可在一下午内完成蛋白与其膜结合情况的评估。在进行该实验操作时，重要的是要估算蛋白质在纳米盘上的面积，以选择合适长度的膜支架蛋白（MSP）。对于尺寸匹配良好的情况，最多可有两个外源蛋白结合，分别位于盘状结构的两侧。此外，负染所用的磷钨酸钠盐必须为钠盐形式，以确保最大程度的堆积；通过比较无堆积现象与不含单向结合蛋白样品中形成长堆积的现象，可确认蛋白结合情况。使用纳米盘替代脂质体，可利用动态光散射和小角X射线散射来进一步探究样品的均一性、粒径或分子结构。对于结合在纳米盘上的单向膜蛋白，其低分辨率三维结构可作为解析这类结合蛋白高分辨率结构的便捷第一步。

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