方法可视化和用透射电子显微镜分析膜蛋白的相互作用

该程序的总体目标是通过负染色透射电子显微镜可视化纳米盘膜表面的外源性膜蛋白的结合，作为蛋白质高分辨率结构测定的第一步。这种方法可以帮助回答多个研究领域中的关键问题，因为它涉及发生在细胞膜内和细胞膜上的蛋白质活动。这种技术的主要优点是如果蛋白质不能与膜结合，则纳米盘形式的特征堆栈。

这些堆栈通过透射电子显微镜清晰可见。该技术的含义延伸到药物开发，因为可以很容易地筛选化合物以阻断或实现膜蛋白相互作用的能力。虽然这种方法可以深入了解单位蛋白与膜结合的最佳条件，但它也提供了蛋白质纳米盘复合物的低分辨率结构。

要开始该程序，表达和纯化膜支架蛋白，例如 MSP1E3D1。接下来，使用带有金属针头的玻璃注射器，将 305 微升每毫升 25 毫克的 POPC 氯仿分配到玻璃圆底烧瓶中。在通风橱中用温和的氮气流蒸发氯仿。

在真空干燥器中干燥剩余的脂质过夜。然后将干燥的脂质饼溶解在 200 μL 富含 100 毫摩尔胆酸钠作为去污剂的 MSP 标准缓冲液中。涡旋混合物直至透明，在缓冲液中获得 50 毫摩尔 POPC 的悬浮液。

接下来，用 30 毫升 100% 甲醇洗涤 5 克疏水珠子，然后用 40 毫升超纯水洗涤，最后用 10 毫升 MSP 标准缓冲液洗涤。将珠子储存在 4 摄氏度的 15 毫升标准缓冲液下。然后将 190 微升 0.124 毫摩尔的 MSP1E3D1 溶液和 61.5 微升 50 毫摩尔的 POPC 悬浮液在缓冲液中混合，得到 MSP 与 POPC 的摩尔比为 1：130，胆酸钠浓度为 25 毫摩尔。

每个 MSP 的理想脂质比例因脂质类型和 MSP 透镜的每种选择而异，必须进行优化以获得纳米圆盘的均匀制备。将混合物在湿冰上孵育 1 小时。然后将溶液添加到每毫升重构混合物中含有 0.5 克洗涤疏水豆的试管中，以启动纳米圆盘自组装。

将混合物在 4 摄氏度下以每分钟 7 到 8 转的速度孵育 16 小时。孵育后，让微珠在重力作用下沉降。取出上清液并储存在 4 摄氏度，直到准备进行尺寸排阻色谱。

在体积排阻色谱法之前，将混合物在 4 摄氏度下以 13， 000 g 离心 10 分钟。倒出上清液并丢弃沉淀。用 MSP 标准缓冲液平衡尺寸排阻色谱柱，直到 280 纳米处的基线稳定。

将上清液注入色谱柱上，以 0.5 mL 的馏分收集产物。用紫外可见分光光度计测量 280 纳米级分的吸光度。使用所选 MSP 的摩尔消光系数计算纳米圆盘的浓度。

要进行非变性凝胶电泳，首先将 15 μL 样品与 5 μL 适当的上样缓冲液混合。用轻质阴极缓冲液填充阴极槽，用运行缓冲液填充阳极槽。将样品上样到 4% 至 16% Bis-Tris 凝胶上并开始电泳。

按照凝胶制造商的说明对凝胶进行染色。为了开始制备以 5 种脂氧合酶为蛋白质的纳米盘单位蛋白复合物，请制备一批富含 1.5 毫摩尔氯化钙的 MSP 标准缓冲液。表达和纯化 5LO 蛋白。

立即在富含钙的 MSP 标准缓冲液中制备 100 微升 0.8 微摩尔 5LO 和 0.8 微摩尔纳米圆盘的混合物。我们的单位蛋白酶 5 脂氧合酶示例取决于与膜结合的钙量。5LO 高度敏感，必须在制备后几个小时内使用。

将混合物在冰上孵育 10 分钟。将所得的 nanodisc 蛋白质复合物样品在 4 摄氏度下储存长达一个月。要开始准备 TEM 分析，请在室温下将 1 克磷钨酸钠盐溶解在 50 毫升超纯水中。

用一摩尔氢氧化钠溶液将溶液 pH 值调节至 7.4。通过 0.22 微米注射器过滤器过滤磷钨酸钠溶液，并将溶液储存在室温下。接下来，以 300 毫安的电流对 400 目碳涂层铜网格进行 20 秒的辉光放电，以使网格表面具有亲水性。

将 2.5 至 5 μL 纳米圆盘单位蛋白复合物样品放在网格上，让样品静置 30 秒。然后用滤纸从网格中吸干多余的溶液。立即滴入一滴磷钨酸钠溶液，让溶液静置 30 秒。

吸干多余的溶液，让网格风干。以 120 至 200 千伏的加速电压进行透射电子显微镜检查。从后续图像处理中排除显示长堆栈的图像。

对于选定的图像，使用标准处理方法来确定类平均值并生成纳米盘单位蛋白的低分辨率 3D 模型。使用这种方法，用 1 比 130 的膜支架蛋白与脂质的比例制备空纳米盘。在尺寸排阻色谱过程中仅观察到一个主峰，在蓝色非变性凝胶电泳中仅观察到一个条带。

当用磷钨酸钠盐溶液处理空的纳米圆盘时，会诱导堆积。然后可以通过 TEM 观察这些长堆栈。在施用磷钨酸钠溶液之前，纳米圆盘溶液中含有钙离子并未破坏这种堆叠。

当单位蛋白（如五种脂氧合酶）与纳米圆盘表面结合时，蛋白质的硬脂酸阻塞阻碍了堆叠。纳米圆盘的两侧可用于结合，允许形成一对一和二对一的 5LO 纳米圆盘复合物。2 对 1 5LO 纳米盘复合物的样品比 1 对 1 样品表现出更少的堆叠。

5LO 结合需要钙离子的存在。通过观察 5LO 和不含钙的纳米圆盘混合物中的堆叠证实了这一点，这表明 5LO 没有结合到膜表面。准备好单位蛋白和纳米圆盘后，如果作得当，可以在一个下午完成蛋白质与膜结合的评估。

在尝试此过程时，重要的是要估计纳米盘上蛋白质的面积以选择正确的 MSP 长度。对于匹配良好的大小，最多两个外源性蛋白可以在圆盘的每一侧结合一个。同样重要的是，将磷酸钨的钠盐用于负片架，以确保最大的堆叠，因为通过将没有堆叠与没有单位蛋白的样品的长堆叠进行比较来确认结合。

使用纳米圆盘代替脂质体可以使用动态光散射、小角 X 射线散射来回答有关样品均匀性、大小或分子结构的其他问题。与纳米圆盘结合的单位膜蛋白的低分辨率 3D 结构可能是这些结合蛋白获得高分辨率结构的第一步。