通过透射电子显微镜可视化与分析膜相互作用蛋白的方法

本实验的总体目标是通过负染色透射电子显微镜技术，观察外周膜蛋白在纳米盘膜表面的结合情况，作为该蛋白高分辨率结构解析的第一步。该方法有助于回答多个研究领域中的关键科学问题，因其涉及发生在细胞膜内及膜上的蛋白质功能活动。该技术的主要优势在于，当蛋白无法与膜结合时，会形成特征性的纳米盘堆叠结构。

这些堆叠结构可通过透射电子显微镜清晰观察到。该技术的应用意义延伸至药物开发领域，因为可以方便地筛选化合物是否具有阻断或促进膜蛋白相互作用的能力。尽管该方法可为单向结合蛋白与膜结合的最佳条件提供见解，但它也能提供蛋白纳米盘复合物的低分辨率结构信息。

开始实验前，首先表达并纯化膜支架蛋白（如 MSP1E3D1）。接着，使用带金属针头的玻璃注射器，将 305 微升浓度为 25 毫克/毫升的氯仿溶解 POPC 加入一个玻璃圆底烧瓶中。在通风橱内，用温和的氮气流蒸发氯仿。

将剩余的脂质在真空干燥器中过夜干燥。然后用200 µL含有100 mM胆酸钠作为去垢剂的MSP标准缓冲液溶解干燥的脂质饼。涡旋混合物至透明，得到缓冲液中50 mM POPC的悬浮液。

接下来，用30毫升100%甲醇洗涤5克疏水性珠子，再用40毫升超纯水洗涤，最后用10毫升MSP标准缓冲液洗涤。将珠子保存在15毫升标准缓冲液中，置于4摄氏度下。然后，将190微升0.124毫摩尔的MSP1E3D1溶液与61.5微升50毫摩尔的POPC悬浮液在缓冲液中混合，得到MSP与POPC摩尔比为1:130，胆酸钠浓度为25毫摩尔。

每种脂质类型和MSP类型组合下的脂质与MSP的最优比例各不相同，必须进行优化以获得均一的纳米盘制剂。将混合物在湿冰上孵育一小时。然后将溶液加入含有每毫升重构混合物体积对应0.5克洗涤过的疏水豆的离心管中，以启动纳米盘的自组装。

将混合物在4 °C、7~8 转/分钟条件下孵育16小时。孵育结束后，静置使磁珠自然沉降。移除上清液并置于4 °C保存，待进行凝胶过滤层析时使用。

在进行凝胶过滤色谱之前，将混合物在4摄氏度下以13,000 g离心10分钟。倾出上清液，弃去沉淀物。用MSP标准缓冲液平衡凝胶过滤色谱柱，直至280纳米处的基线稳定。

将上清液注入层析柱，并以0.5毫升的组分收集产物。使用紫外-可见分光光度计在280纳米处测定各组分的吸光度。根据所选膜支架蛋白（MSP）的摩尔消光系数计算纳米盘的浓度。

进行非变性凝胶电泳时，首先将15微升样品与5微升适当的上样缓冲液混合。用轻阴极缓冲液填充阴极槽，用运行缓冲液填充阳极槽。将样品上样至4%–16% Bis-Tris凝胶，并开始电泳。

根据凝胶生产商的说明书对凝胶进行染色。为了开始制备含有五种脂氧合酶作为蛋白质的纳米盘单向蛋白复合物，需配制一批含有1.5毫摩尔氯化钙的MSP标准缓冲液。表达并纯化5LO蛋白。

立即在钙离子富集的MSP标准缓冲液中配制100微升含0.8微摩尔5-脂氧合酶（5LO）和0.8微摩尔纳米盘的混合液。以我们的单向整合膜蛋白酶5-脂氧合酶为例，其结合膜的能力依赖于钙离子浓度。5LO具有高度敏感性，必须在配制后数小时内使用。

将混合物在冰上孵育10分钟。将所得的纳米盘蛋白复合物样品在4摄氏度下保存，最长可保存一个月。开始透射电子显微镜（TEM）分析前的准备时，在室温下将1克磷钨酸钠盐溶解于50毫升超纯水中。

用1摩尔氢氧化钠溶液将溶液pH值调节至7.4。将磷钨酸钠溶液经0.22微米注射器滤器过滤，室温保存。随后，对400目碳膜铜网进行辉光放电处理，电流30毫安，持续20秒，以使网格表面具有亲水性。

取 2.5 至 5 微升纳米盘单拓扑蛋白复合物样品滴加至载网上，静置 30 秒。随后用滤纸吸去载网上的多余溶液。立即滴加一滴磷钨酸钠溶液，并让溶液静置 30 秒。

吸去多余溶液，使载网自然晾干。使用120至200千伏的加速电压进行透射电子显微镜观察。在后续图像处理中排除显示长串叠层的图像。

对于所选图像，采用标准处理方法确定纳米盘单拓扑蛋白的类别平均图像，并生成其低分辨率三维模型。通过该方法，以膜支架蛋白与脂质1:130的比例制备了空纳米盘。在尺寸排阻色谱中仅观察到一个主要峰，蓝色天然凝胶电泳中也仅观察到一条条带。

当空的纳米盘与磷钨酸钠盐溶液处理时，会诱导产生堆叠结构。这些长串的堆叠结构可通过透射电子显微镜（TEM）观察到。在加入磷钨酸钠溶液前，纳米盘溶液中添加钙离子并不会破坏这种堆叠现象。

当五脂氧合酶等单拓扑结构蛋白结合到纳米盘表面时，蛋白的空间位阻会阻碍纳米盘的堆叠。纳米盘的两侧均可用于结合，从而形成一比一和二比一的5LO-纳米盘复合物。二比一5LO-纳米盘复合物样品的堆叠程度低于一比一的样品。

5LO 的结合需要钙离子的存在。这一点通过观察不含钙离子的 5LO 与纳米盘混合物中出现的堆积现象得以证实，表明 5LO 未结合到膜表面。一旦单向整合蛋白和纳米盘制备完成，若操作得当，可在一下午内完成蛋白与其膜结合情况的评估。

在进行该实验操作时，重要的是要估算蛋白质在纳米盘上的面积，以选择合适长度的膜支架蛋白（MSP）。对于尺寸匹配良好的情况，最多可有两个外源蛋白结合，分别位于盘状结构的两侧。此外，负染所用的磷钨酸钠盐必须为钠盐形式，以确保最大程度的堆积；通过比较无堆积现象与不含单向结合蛋白样品中形成长堆积的现象，可确认蛋白结合情况。

使用纳米盘替代脂质体，可利用动态光散射和小角X射线散射来进一步探究样品的均一性、粒径或分子结构。对于结合在纳米盘上的单向膜蛋白，其低分辨率三维结构可作为解析这类结合蛋白高分辨率结构的便捷第一步。