在人上皮小肠样模型中诱导坏死性小肠结肠炎

获得人小肠组织来源的隐窝——含有干细胞和各种类型上皮细胞的肾小管内陷。

肠隐窝添加到冷藏的地下室基质中。

该混合物转移到多孔板中，形成一个三维圆顶。

加入生长培养基并孵育。

干细胞自组织、增殖并分化成多种类型的肠道细胞，形成肠球。

随着时间的推移，肠球成熟为肠样细胞——三维自我更新结构，类似于肠隐窝。

将脂多糖或LPS（一种细菌内毒素）加入含有肠类毒素的孔中并孵育。

LPS 分子与肠样受体结合，引发促炎反应，导致活性氧的积累。这会引发一系列导致细胞凋亡的事件。

因此，肠样的完整性受到损害，导致 LPS 渗透到管腔中，进一步加剧炎症反应。

这模仿了坏死性小肠结肠炎的发展，坏死性小肠结肠炎是早产儿肠道中的一种严重炎症。

手术室采集时，将人体小肠组织样本放入冷 DPBS 中。在冷的 DPBS 中清洗标本，直到它没有血液和粪便。

标本储存在 4 摄氏度的 RPMI 1640 培养基中，直到准备好进行隐窝分离。准备好继续时，再次检查以确保标本上没有粪便和血液。使用精致的解剖剪刀，去除任何多余的脂肪或手术夹和订书钉。称量标本，目标是大约 0.75 至 2.5 克的标本。

接下来，将组织切成 0.5 厘米的块，并将它们放入装有 30 毫升螯合缓冲液 #1 的管中。在四摄氏度下低速摇晃15分钟。然后，通过 100 微米细胞过滤器过滤组织，并丢弃流过的组织。

过滤后的组织加入装有 30 毫升螯合缓冲液 #2 的试管中。在四摄氏度下低速摇晃15分钟。通过 100 微米过滤器过滤组织，并丢弃流通。

之后，在冰上解冻 500 微升基底膜基质以备后用。在50毫升锥形管中加入一些组织到10毫升冷DMEM中，用手剧烈摇晃10秒钟。通过 100 微米细胞过滤器过滤该悬浮液，并收集流过的滤液。将此管子放在冰上。

单独的 50 毫升锥形管中将一些组织加入另外 10 毫升冷 DMEM 中，用手剧烈摇晃 10 秒钟。通过 100 微米细胞过滤器过滤该悬浮液，并收集流过的滤液。

再重复此过程两次，直到有四个锥形管，其中包含标记为一到四的流通管。然后，通过 100 微米的细胞过滤器过滤 1 号管中的溶液，并将流过的溶液转移到同样标有 1 号的 15 毫升锥形管中。对第二到第四管重复此过程。

15 毫升试管以 200 倍 g 和 4 摄氏度离心 15 分钟。在层流罩中，从每个管中取出上清液，并将其丢弃。避免破坏沉淀正上方的组织云，即使这意味着留下一些上清液。在每个试管中，缓慢上下移液，使沉淀与剩余的上清液混合。

混合物从每个管中转移到单个 2 毫升锥形管中，并在 200 倍 g 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。之后，除去上清液，并将沉淀重悬于500微升预解冻的基底膜基质中。

使用冷却的移液器吸头将 50 微升这种悬浮液涂抹到 24 孔板中的孔中心。该样品应呈圆顶形。重复此应用过程九次，总共填充 10 个孔。

24 孔板转移到 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中 30 分钟以进行聚合。然后，向每个孔中加入 500 微升完整的人微型肠道培养基。在相同条件下继续孵育，确保每两天更换一次该培养基。