用于表征淋巴细胞亚型的三维定量相位成像

将淋巴细胞亚型悬浮液加载到成像室中。

腔室放置在 3D 定量相位成像显微镜载物台上。

调整显微镜参数和焦平面以获得最佳成像。

在淋巴细胞成像过程中，激光束分为参考光束和样品光束。

数字微镜装置在样品光束的路径中具有微镜阵列，允许光束绕光轴旋转360度。

过淋巴细胞的每束光束都会根据细胞内的折射率变化经历相移。

生成的样品和参考光束重新组合，形成 2D 全息图。

淋巴细胞的光束旋转捕获一系列包含不同角度的相位和振幅信息的全息图。

获取具有不同照明角度的多个背景全息图，不包括淋巴细胞。

使用衍射断层扫描算法，将全息图重建为 3D 折射率断层扫描，无需标记即可提供淋巴细胞的形态学和生化信息。

为了获得最佳成像效果，将每个细胞样品稀释至每微升 RPMI 培养基 180 个细胞的浓度，然后将 120 微升第一个稀释样品缓慢注入成像室。确认室内没有气泡后，将一滴蒸馏水滴在3D定量相位显微镜的物镜上，将成像室放在显微镜的平移台上。调整载物台，使样品与物镜对齐，在成像软件显微镜视角的校准选项卡中单击焦点和表面，分别调整物镜和聚光镜的轴向位置。

单击自动模式以对齐物镜和聚光镜。要优化对准，请打开扫描模式并手动调整透镜以将数字微镜设备图案对齐到中心。然后，返回正常模式，并调整平移阶段以定位视野中的单元格。调整物镜的轴向位置以找到焦平面，直到屏幕上可视化的样品边界几乎看不见。

完美调整细胞的焦点以生成最佳的 3D RI 断层扫描非常重要。如果图像拍摄不当，3D 重建将受到损害，导致断层扫描产生噪声。

调整平移阶段以查找没有单元格的位置，然后单击"校准"以测量具有不同照明角度的多个 2D 全息影像。调整平移阶段以在视野中心找到一个单元格，然后在采集选项卡下，命名正在成像的样品。

单击"3D 快照"，使用与刚刚测量的 2D 全息影像相同的照明角度来测量单元格的全息影像。当采集的数据出现在数据管理面板中时，右键单击数据，然后单击"处理"，使用成像软件中实现的衍射断层扫描算法从2D全息图重建3D折射率断层扫描。映像后，在"数据管理"面板中，右键单击"数据"，然后单击"打开"以可视化数据。

单击单元格的中心以重新定位它，然后单击"数据管理器"面板上的"RI 断层图"。在预设选项卡上，单击加载并双击lymphocytes.xml，这是成像软件提供的预定义传递函数，用于根据 3D RI 分布可视化断层扫描。滚动鼠标以放大，然后拖动单元格以向任意方向旋转。