Name: 三维人体免疫细胞可视化的光片显微术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 了解光片显微术在三维胶原基质中可视化人体免疫细胞的方法。该技术可实现快速成像并减少光毒性，用于追踪细胞迁移模式，为免疫学和细胞生物学研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢临床止血学与输血医学研究所提供供体血液；感谢Carmen Hässig和Cora Hoxha提供的出色技术帮助。感谢Jens Rettig（萨尔兰大学）提供改良的pMAX载体，Roland Wedlich-Söldner（明斯特大学）提供原始的LifeAct-Ruby质粒，以及Christian Junker（萨尔兰大学）构建LifeAct-mEGFP质粒。本项目由特别研究领域基金Sonderforschungsbereich 1027（项目A2，负责人B.Q.）和894（项目A1，负责人M.H.）资助。光片显微镜由德国研究基金会（DFG，项目编号：INST 256/4 19-1 FUGG）资助。

本研究中使用的人体材料（来自献血者的白细胞去除系统腔室）已获得当地伦理委员会批准（2015年4月16日声明（84/15；Prof. Dr. Rettig-Stürmer）），并遵循相应的指导原则。
1. 中和胶原蛋白溶液的制备（500 µL）
<ol>
	<li>在细胞培养操作台内，将400 µL预冷的胶原蛋白储备液（10.4 mg/mL）转移至无菌的1.5 mL离心管中。缓慢加入50 µL预冷的10倍浓度PBS缓冲液（pH 7.0 -&#160;7.3）至400 µL预冷的胶原蛋白储备液中。通过轻轻倾斜离心管的方式混匀溶液。 
	注意：第1部分的所有操作均应在细胞培养操作台内进行。</li>
	<li>向步骤1.1中得到的500 µL胶原蛋白溶液中加入8 µL的0.1 M NaOH，以调节pH至7.2–7.6。使用pH试纸（pH范围：6–10）测定混合液的pH值。 
	注意：不同批次的胶原蛋白所需体积可能有所不同。NaOH溶液必须缓慢混合，以避免产生气泡。混合过程中应将溶液置于冰上，防止胶原蛋白发生凝胶化。</li>
	<li>加入2 µL无菌ddH2O，使终体积达到500 µL。充分混匀后，将此胶原蛋白溶液（8.32 mg/mL）置于冰上或4 °C保存，待后续使用。 
	注意：在此条件下，中和后的胶原蛋白可在24小时内使用。不建议分装，以避免引入气泡。</li>
</ol>
2. 使用毛细管进行光片荧光显微镜成像的样品制备
<ol>
	<li>按照先前所述方法，使用所需的初级荧光染料15或荧光蛋白11对目标活细胞进行荧光标记。</li>
	<li>在细胞培养罩内，将1 × 106个细胞转移至无菌的1.5 mL离心管中。以200 × g离心8分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于200 µL培养基中。 
	注意：建议细胞密度为5 × 106个细胞/mL，以便观察人免疫细胞迁移，尤其是细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞。</li>
	<li>将步骤1.3中制备的中和胶原溶液85.9 µL加入步骤2.2的细胞悬液中，充分混匀，使胶原终浓度达到2.5 mg/mL。将细胞/胶原混合物置于冰上，放置在罩内。 
	注意：若所需胶原浓度为N mg/mL，则中和胶原溶液的体积（用于200 µL细胞悬液）= 200 × N/(8.32 - N)</li>
	<li>随后，将匹配的推杆插入毛细管（内径约1 mm），直至推杆从毛细管末端伸出1 mm。将推杆浸入培养基中润湿&#160;（图1A）。 
	注意：此步骤有助于防止毛细管插入细胞/胶原混合物时产生气泡。毛细管和推杆无需无菌。</li>
	<li>将毛细管插入步骤2.3制备的细胞/胶原混合物中，缓慢向后拉动推杆10–&#160;20 mm（图1B）。用70%乙醇喷雾润湿的纸巾擦拭毛细管外壁，以去除残留的胶原溶液。</li>
	<li>用建模黏土将毛细管&#160;固定在5 mL离心管内壁上，并将细胞/胶原混合物推至毛细管末端&#160;（图1C）。</li>
	<li>将毛细管置于37 °C、5% CO2环境中孵育1小时，以完成胶原聚合。</li>
	<li>向5 mL离心管中加入培养基（约1–2 mL）。小心地将聚合后的胶原柱压出，使其约3/4部分悬于培养基中（图1D）。</li>
	<li>将毛细管保持在此状态下，在37 °C、5% CO2环境中继续孵育30分钟，使胶原柱与培养基达到平衡。 
	注意：此后，可将胶原柱重新拉回毛细管中继续培养，待后续使用。</li>
</ol>
3. 使用光片显微镜进行图像采集
<ol>
	<li>根据制造商的说明组装样品室。</li>
	<li>打开培养箱和显微镜，将样品室加热至 37 °C（仅适用于活细胞成像）。</li>
	<li>将毛细管放入样品室中，并定位样品以&#160;找到用于图像采集的兴趣区域。</li>
	<li>激活相应的激光器。设置以下参数：激光功率、曝光时间、z 轴步进间距、z 轴扫描的起始和终止位置，以及活细胞成像的时间间隔。 
	注意：例如，图2中的样品在 37 °C 下每隔 40 秒成像一次，持续 6 小时，z 轴步进间距为 1 µm（总厚度：538 µm）。激光功率为 1%，曝光时间为 30 ms。x-y 方向的像素大小为 0.23 µm。</li>
	<li>开始图像采集。</li>
</ol>
4. 自动化追踪分析
<ol>
	<li>打开文件转换器，点击 添加文件 以选择要转换为软件文件格式（*.ims）的成像文件。点击 浏览 并选择一个文件夹以保存转换后的文件。点击 全部开始。</li>
	<li>打开分析软件。点击 Surpass。进入 文件 菜单并点击 打开，然后选择要分析的成像文件。 
	注意：如果文件较大，此步骤可能需要较长时间。不建议单个实验使用大于1太字节（TB）的文件，因为处理如此大的文件对计算能力要求极高。</li>
	<li>点击 添加新斑点。勾选 最后处理整幅图像 选项框。点击 下一步。</li>
	<li>输入 x 和 y 的坐标（以像素为单位）以定义感兴趣区域。输入要分析的帧数（时间和 z 位置）。点击 下一步。</li>
	<li>在 源通道 下拉列表中选择目标通道，该通道包含待追踪的对象。输入 估计的 xy 直径（单位为 µm）。点击 下一步。 
	注意：估计的 xy 直径 是指待追踪对象在 x-y 维度上的平均直径。</li>
	<li>点击 质量。设置一个阈值，使大多数细胞（对象）都能被包含在内。点击 下一步。&#160;</li>
	<li>选择所需的算法（推荐使用 自回归运动 算法）。输入最大距离（推荐值为 20 µm）和最大间隙大小（推荐值为 3 或 2）。点击 最后处理整幅图像。 
	注意：最大距离 和 最大间隙大小 是用于中断轨迹的两个阈值。具体而言，在两个连续帧中，若同一对象之间的距离超过最大距离，则后续帧中的该对象将被视为新对象。有时在采集过程中，同一对象可能在若干帧中消失后再次出现。在此情况下，只有当该对象在最大间隙大小范围内重新出现时，才会被视为同一对象。</li>
	<li>点击 过滤类型 并选择排除不需要的轨迹的选项。 
	注意：此步骤为可选步骤。</li>
	<li>点击 下一步，然后点击 完成。 
	注意：此步骤可能需要数小时至数天，具体取决于计算性能。</li>
	<li>点击 编辑轨迹 并选择 校正漂移。选择合适的算法（推荐使用 平移漂移 算法）。选择所需的结果数据集大小（推荐选择 新大小等于当前大小）。点击 确定。 
	注意：仅当图像采集过程中胶原发生漂移时才需要执行此步骤。</li>
	<li>点击 统计 并选择 配置可见统计值列表。勾选需要导出的选项（例如坐标、速度等）。点击 确定。</li>
	<li>点击 将所有统计数据导出到文件 并输入文件名。</li>
</ol>
5. 胶原基质中细胞的固定与免疫荧光染色
<ol>
	<li>在通风橱内，将 1,000 µL 的 4% 多聚甲醛（PFA，溶于 PBS）转移至 5 mL 离心管中。 
	注意：PFA 应平衡至室温。</li>
	<li>将来自步骤 2.9 的含有聚合胶原的毛细管浸入 PFA 溶液中（约 5 mm），并使用橡皮泥将毛细管固定在 5 mL 管的内壁上（如 图 1C 所示）。</li>
	<li>轻轻推动推杆，使一半的胶原柱悬于 PFA 溶液中（图 1D）。将离心管置于室温下静置 20&#160;min。</li>
	<li>回拉推杆，使胶原柱重新进入毛细管内。取出毛细管并弃去 PFA。</li>
	<li>将毛细管放入新的离心管中，并加入 1 mL PBS。确保毛细管完全浸没在 PBS 中。</li>
	<li>轻轻推动推杆，使一半的胶原柱悬于溶液中。用橡皮泥将毛细管固定在管内壁上。</li>
	<li>将离心管置于室温下静置 5 min。</li>
	<li>重复步骤 5.4–5.7 共 2 次。</li>
	<li>回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。弃去 PBS。向管中加入 1–&#160;2 mL 封闭/通透缓冲液（PBS + 1% BSA + 0.1% 非离子型表面活性剂），并重复步骤 5.6。 
	注意：BSA（1%）可用&#160;5% 的用于制备二抗的动物血清替代。</li>
	<li>将离心管置于室温下静置 30–60 min。</li>
	<li>回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。弃去通透缓冲液。加入 200–500 µL 用封闭/通透缓冲液稀释的一抗，并将胶原柱推出至溶液中。</li>
	<li>将离心管置于室温下孵育 1 h。</li>
	<li>按照步骤 5.4–&#160;5.8 所述方法，用 PBST（PBS + 0.1% 非离子型表面活性剂）洗涤胶原柱 3 次。</li>
	<li>在避光条件下，用含有二抗的封闭/通透缓冲液室温孵育胶原柱 1 h。&#160;</li>
	<li>按照步骤 5.4–&#160;5.8 所述方法，用 PBS 洗涤胶原柱 3 次。</li>
	<li>回拉推杆，使胶原柱进入毛细管内。将样品保存在 PBS 中，直至成像。</li>
	<li>按照步骤 3 所述方法对样品进行扫描。</li>
</ol>

<ol><li>Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+anti-migratory+drugs+be+screened+in+vitro%3F+A+review+of+2D+and+3D+assays+for+the+quantitative+analysis+of+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration.</a> Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).</li>
<li>Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimensions+in+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimensions in cell migration.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).</li>
<li>Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+migration%2C+search+strategies+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell migration, search strategies and mechanisms.</a> Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).</li>
<li>Entschladen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+methods+of+human+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis methods of human cell migration.</a> Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).</li>
<li>Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+as+a+cell+survival+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix as a cell survival factor.</a> Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cell+migration%3A+a+multiscale+tuning+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model.</a> J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture+systems%3A+advantages+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture systems: advantages and applications.</a> J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).</li>
<li>Fang, Y., Eglen, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Cell+Cultures+in+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development.</a> SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).</li>
<li>Schoppmeyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+profilin+1+is+a+negative+regulator+of+CTL+mediated+cell-killing+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration.</a> Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).</li>
<li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+driven+by+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li>
<li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+cells+enhance+NK+cytotoxic+efficiency+by+reducing+search+time%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time.</a> Sci Rep. 7, 44357(2017).</li>
<li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).</li>
<li>Petrie, R. J., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((At+the+leading+edge+of+three-dimensional+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">At the leading edge of three-dimensional cell migration.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).</li>
<li>Imamura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2D-+and+3D-culture+models+as+drug-testing+platforms+in+breast+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer).</a> Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microenvironment+alters+protein+expression+and+chemosensitivity+of+epithelial+ovarian+cancer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro.</a> Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).</li>
<li>Luca, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+the+3D+microenvironment+on+phenotype%2C+gene+expression%2C+and+EGFR+inhibition+of+colorectal+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines.</a> PLoS One. 8 (3), e59689(2013).</li>
<li>Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+phototoxicity+during+the+development+of+a+zebrafish+craniofacial+bone+using+confocal+and+light+sheet+fluorescence+microscopy+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques.</a> J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).</li>
<li>Graf, B. W., Boppart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+analysis+of+three-dimensional+cell+culture+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models.</a> Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Verveer, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+large+specimens+with+light+sheet-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy.</a> Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
</ol>

作者声明不存在任何财务或商业利益冲突。

大多数 体外 实验在二维表面进行，例如在细胞培养板、培养皿或盖玻片上，而 体内 细胞，尤其是免疫细胞，所处的微环境大多为三维（3D）环境。越来越多的证据表明，免疫细胞的迁移模式在二维（2D）与三维（3D）条件下存在差异。17此外，肿瘤细胞在二维和三维培养组织中的表达谱也存在差异。18,19,20因此，为了最好地模拟生理条件 体外在三维环境中进行实验具有显著优势，例如在三维胶原基质中开展研究。近年来发展的新技术，尤其是光片荧光显微镜技术，能够在受控的环境条件下，对三维基质系统实现可靠且可重复的实验观察。
与传统的激光扫描共聚焦显微镜对整个样品进行照明不同，光片显微镜仅生成一薄层激光光片来照射样品。检测相机的成像平面与照明平面垂直。由于该技术的特点，只有处于焦平面的样品区域受到激光照射，因此可最大限度...

目前关于迁移细胞的大多数知识均来自二维实验1,2,3，这些实验通常在培养皿或成像皿的玻璃或塑料表面进行。然而，在大多数生理情况下，细胞需要三维微环境，其中细胞外基质（ECM）起着决定性作用。ECM不仅提供了维持细胞正常形态所必需的三维结构，还为多种细胞的正常功能提供生存信号或方向性引导4,5。因此，需要在更接近生理条件的三维环境中研究细胞，以更准确地识别其功能和行为。
在人体内，大多数细胞尤其是免疫细胞，其功能发挥通常处于三维环境之中。例如，活化的T细胞在组织中巡逻以寻找靶细胞，而初始T细胞则迁移穿过淋巴结以寻找相应的抗原呈递细胞，在此过程中，其迁移模式和迁移机制会适应相应的细胞外环境3,6,7。三维胶原凝胶已被广泛用作一种成熟且特征明确的三维细胞培养系统8,9,10。我们先前的研究表明，原代人淋巴细胞具有高度移动性，在0.25%的胶原基质中平均迁移速度约为4.8 µm/min11。细胞骨架的重排在细胞迁移过程中起着关键作用12。越来越多的证据表明，淋巴细胞并非仅采用单一的迁移模式，而是能够根据位置、微环境、细胞因子、趋化梯度以及细胞外信号的不同，以多种方式调节其迁移行为，从而在不同条件下切换迁移模式3。
为了可靠地分析免疫细胞的功能和行为（例如迁移、突起形成或囊泡运输），能够以快速且可靠的方式获取相对大体积的三维图像具有显著优势。对于三维成像，近年来发展的光片显微技术（也称为单平面照明显微技术）提供了一个令人满意的解决方案13,14。在图像采集过程中，通过生成一束薄而稳定的光片来照射样品。这种方式可在焦平面上同时照亮较大区域，而不会影响焦平面外的细胞。该特性使得成像速度显著提高，同时极大减少了光漂白和光细胞毒性。本文中，我们描述了如何利用光片显微技术对原代人免疫细胞进行可视化，以及如何在三维环境中分析其迁移行为。

<table><tbody><tr><td>牛胶原蛋白溶液 Fibricol</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>&amp;nbsp;#5133-20ML</td><td>胶原蛋白基质</td></tr><tr><td>0.5 M NaOH 溶液</td><td>Merck</td><td>1091381000</td><td>用于中和 Fibricol 溶液</td></tr><tr><td>超低熔点琼脂糖</td><td>Affymetrix</td><td>32821-10GM</td><td>低 c[Col] 条件下的样品制备</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>11348D</td><td>从外周血单个核细胞（PBMC）中分离原代人 CD8&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; T 细胞</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation</td><td>Thermo Fisher</td><td>11132D</td><td>细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）群体的激活</td></tr><tr><td>人重组白细胞介素-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHC0023</td><td>培养的 CTL 刺激</td></tr><tr><td>P3 原代细胞转染试剂盒（P3 Primary solution kit）</td><td>Lonza</td><td>V4XP-30XX</td><td>转染</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-PFN1 抗体，兔源 IgG</td><td>Abcam</td><td>ab124904</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22284</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>CellMask Orange 细胞膜染料</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10045</td><td>荧光细胞标记</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-250mL</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Eurobio</td><td>018774</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>DPBS 杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's phosphate buffered saline）</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A9418-100G</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>山羊抗兔 568 抗体（Goat &amp;alpha; Rabbit 568），IgG，兔源</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11011</td><td>免疫荧光（IF）</td></tr><tr><td>Lightsheet Z.1（光片显微镜）</td><td>Zeiss</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养超净台</td><td>Thermo Fisher</td><td>HeraSafe KS</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵箱 HERACell 150i&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>离心机 5418 和 5452</td><td>Eppendorf</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000039, 3123000020, 3123000063</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>VWR</td><td>89079-444, 89079-436, 89079-452&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>&amp;nbsp;62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>50 &amp;micro;L 毛细管</td><td>VWR (Brand)</td><td>613-3373</td><td>Zeiss LSFM 样品制备</td></tr><tr><td>毛细管推杆</td><td>VWR (Brand)</td><td>BRND701934</td><td>&quot;带聚四氟乙烯（Teflon）头的冲压工具&quot;，用于 LSFM 样品制备</td></tr><tr><td>MColorPhast pH 试纸</td><td>Merck</td><td>1095430001</td><td>检测中和后 Fibricol 的 pH 值</td></tr><tr><td>BD Plastipak 1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>Z230723&amp;nbsp;ALDRICH</td><td>替代样品制备方法</td></tr><tr><td>模型黏土（Hasbro Play-Doh A5417EU7）</td><td>Play-Doh</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 文件转换器</td><td>Bitplane</td><td>可从 http://www.bitplane.com&amp;nbsp; 获取</td><td>将成像文件转换为 Imaris 文件格式</td></tr><tr><td>Imaris 8.1.2（MeasurementPro, Track, Vantage）</td><td>Bitplane</td><td>可从 http://www.bitplane.com&amp;nbsp; 获取</td><td>三维和四维成像数据的分析</td></tr></tbody></table>

光片显微镜用于人免疫细胞的三维可视化

Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells

体内，免疫细胞的活化、增殖和功能发挥均发生在三维（3D）环境中，例如淋巴结或组织中。迄今为止，大多数 体外 系统依赖于二维（2D）表面，例如细胞培养板或盖玻片。为更充分地模拟生理条件 体外我们采用一种简单的三维胶原基质。胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分之一，已被广泛用于构建三维基质。对于三维成像，近年来发展的光片显微技术（也称为单平面照明显微技术）具有高采集速度、大穿透深度、低光漂白和低光细胞毒性等优点。此外，光片显微技术特别适用于长期观测。本文描述了一种优化的实验方案，用于建立和处理人免疫细胞， 例如 在3D胶原蛋白基质中培养原代人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和自然杀伤（NK）细胞，用于光片显微镜对活细胞成像及固定样本的观察。本文介绍了细胞迁移的图像采集与分析流程，重点强调了样本制备和数据分析中的关键步骤与影响因素。该方案也可适用于其他类型的悬浮细胞在3D胶原蛋白基质中的研究，不仅限于免疫细胞。

T细胞迁移过程中的突起形成是一个高度动态且依赖肌动蛋白的过程。为了可视化原代人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的突起形成，我们如前所述11，瞬时转染了与mEGFP融合的蛋白以标记CTL中的肌动蛋白细胞骨架。转染后一天，将细胞包埋于胶原基质中。使用光片显微镜在37 °C条件下，以每40秒一次的频率、1 µm的步长采集图像序列。如图2A和补充视频1所示，在迁移过程中，人CTL形成呈柠檬状的主要突起，其边缘带有细小的纺锤样结构。本实验中成像的不仅是一个单细胞，而是一个大体积区域（450 × 450 × 538 µm3）（图2B）。因此，此处展示的光学质量和分辨率是使用低倍物镜（20X / 1.0 DIC VIS IR）获得的。因此，使用更高数值孔径（NA）的物镜可进一步提高分辨率。
<p class="jove_content" fo:keep-toge...

本文介绍了一种利用光片显微镜对嵌入三维（3D）胶原基质中的免疫细胞进行可视化观察的实验方案。该方案还详细阐述了如何在三维环境中追踪细胞迁移过程。此方法同样适用于其他类型的悬浮细胞在三维基质中的研究。

在体内，免疫细胞的活化、增殖和功能均发生于三维（3D）环境中，例如淋巴结或其他组织。

该方法有助于解答免疫学领域的关键问题，例如免疫细胞在生理相关环境中的具体行为，以及如何在三维环境中高效搜寻靶细胞。该方法的主要优势在于能够生成一束极薄的光，仅照射焦平面，而不影响焦平面外的细胞。这使得成像速度显著加快，同时大幅减少光漂白和光细胞毒性。本实验操作将由我实验室的博士后赵Renping博士演示。首先，在细胞培养超净台内，将400微升冰冷的胶原蛋白储备液转移至无菌的1.5毫升离心管中。然后缓慢加入50微升冰冷的10倍浓度磷酸盐缓冲液（10X PBS）。然后通过轻轻倾斜试管来混匀溶液。向胶原溶液中加入 48 微升 0.1 摩尔的氢氧化钠，以将 pH 值调节至 7.2 至 7.6。使用 pH 试纸测定混合液的 pH 值。加入两微升无菌去离子蒸馏水，使终体积达到500微升。充分混匀后将胶原蛋白溶液置于冰上或4摄氏度保存，以备后续使用。根据文本方案对活细胞进行荧光标记后，在细胞培养罩内，将1×10⁶个细胞转移至无菌的1.5毫升离心管中。将离心管在200 × g条件下离心8分钟。然后弃去上清液，加入200 µL培养基重悬沉淀。向细胞悬液中加入85.9 µL中和的胶原蛋白溶液，充分混匀，使胶原蛋白终浓度为2.5 mg/mL。将细胞胶原混合物置于生物安全柜中的冰上。接着，将推杆插入匹配的毛细管中，直至推杆从毛细管末端伸出1毫米。然后将推杆浸入培养基中以润湿。跳过此步骤可能导致柱塞与胶原基质之间意外引入气泡。将毛细管插入细胞-胶原混合液中，缓慢回拉柱塞10至20毫米。然后用装有70%乙醇的喷雾瓶将纸巾润湿，用其擦拭毛细管外壁，以去除残留的胶原溶液。现在使用建模黏土将毛细管固定在5毫升离心管的内壁上。将细胞-胶原混合物推至毛细管边缘。然后将带有毛细管的离心管置于37摄氏度、5%CO2条件下孵育1小时，以使胶原聚合。孵育结束后，向试管中加入一到两毫升培养基。然后小心地将聚合的胶原蛋白凝胶柱排出至培养基中，使约一半的胶原蛋白悬于培养基内。再将毛细管孵育30分钟。进行光片显微镜成像时，按照制造商的说明组装样品室。若进行活体成像，先打开显微镜和培养箱，然后将毛细管放入样品室中，定位样品并找到用于图像采集的兴趣区域。激活相应的激光器。然后设置激光功率和曝光时间。同时设置Z轴扫描的步进大小、Z轴扫描的起始和终止位置，以及活细胞成像的时间间隔。然后开始图像采集。在化学通风橱中，将1毫升4%多聚甲醛PBS溶液转移至一个5毫升离心管中。然后将含有聚合胶原的毛细管浸入多聚甲醛溶液中，并使用模型黏土将毛细管固定在管内壁上。轻轻按压推杆，直至一半的胶原柱悬垂于多聚甲醛溶液中。然后回拉活塞，将胶原棒重新吸入毛细管中。将毛细管从管中取出，弃去多聚甲醛。将毛细管装入新的离心管中，并加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）。确保毛细管浸没在 PBS 中。轻轻按压柱塞，使胶原蛋白棒的一半悬于溶液中，孵育五分钟。回拉柱塞，将胶原蛋白棒吸入毛细管内。然后用新鲜的 PBS 替换原有的 PBS，并将胶原蛋白棒排入溶液中。第三次洗涤后，向试管中加入一到两毫升封闭透化缓冲液。将胶原蛋白棒排入溶液，并在室温下孵育 30 至 60 分钟。用 200 至 500 微升含一抗的封闭透化缓冲液替换原有的封闭透化缓冲液，将浸没的胶原蛋白棒置于该溶液中孵育一小时。用 PBST 将胶原蛋白棒洗涤三次后，将其在含二抗的封闭透化缓冲液中室温孵育一小时。再用 PBS 洗涤三次后，将胶原蛋白棒重新拉回毛细管中，并将样品保存在 PBS 中直至成像。如本视频所示，在迁移过程中，转染了EGFP-肌动蛋白融合蛋白的CTL细胞形成了柠檬形的主要突起，边缘伴有细长的纺锤状结构。此处用速度和持续性（即位移除以总轨迹长度）作为测量参数来描述CTL细胞的运动轨迹。速度范围为0.01至0.19微米/秒，差异近20倍；持续性范围为0至0.7。该图显示了在三维胶原凝胶中固定的CTL细胞，对内源性穿孔素-1和肌动蛋白进行染色。样品从单侧或双侧进行照明。从不同的Z轴位置观察，细胞染色均匀，表明抗体对胶原凝胶具有良好的穿透性。固定后的CTL细胞表现出与活细胞相同的形态，表明该实验方案能很好地维持细胞形态。在进行此操作时，必须注意避免产生气泡，并正确调节pH值。在完成本步骤后，可进一步采用其他方法，例如使用特定表面分子对活细胞进行染色，以探讨更多科学问题，如细胞行为与分化过程或不同细胞亚群之间的关联，或用于研究细胞间相互作用及细胞命运。该技术问世后，为细胞生物学、免疫学和癌症研究领域的研究人员探索细胞行为、细胞命运、分化以及细胞间相互作用提供了最接近生理条件的体外实验体系。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备包埋于三维胶原基质中的细胞样本，如何利用光片显微镜对活体或固定样本进行成像，以及如何在三维环境中追踪细胞迁移过程。

light-sheet-microscopy-for-three-dimensional-visualization-human

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

三维人体免疫细胞可视化的光片显微术

在本视频中，我们介绍了一种晶格光片显微镜技术，用于可视化活体T细胞与抗原呈递细胞之间的相互作用。该方法通过将超薄的晶格光片聚焦于正在相互作用的细胞对上，获取一系列二维图像，并将这些图像进行整合，从而获得高分辨率的四维图像，揭示细胞间相互作用的空间-时间动态过程。...

使用晶格光片显微镜可视化活细胞中受体-配体相互作用

通过空间调制多焦点双光子显微镜的激发模式，可在成年小鼠淋巴结中实现高达120 µm深度的高分辨率活体成像，并增强对比度。在100 µm深度处，测得的分辨率为487 nm（横向）和551...

高分辨率活体条纹照明显微成像技术观察生发中心

本文描述了一种单平面 illumination...

宽场显微镜的单平面照明模块与微毛细管方法

本文介绍了一种用于分析人原代T细胞与抗原呈递细胞之间免疫突触的定性和定量完整工作流程。该方法基于成像流式细胞术，可在相对较短的时间内获取并分析数千个细胞的图像。...

利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR...

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。...

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

我们描述了一种利用定量相位成像和机器学习算法进行无标记淋巴细胞亚型鉴定的实验方案。通过对淋巴细胞的三维折射率断层图像进行测量，可获得单个细胞的三维形态学和生物化学信息，随后利用机器学习算法分析这些信息以实现细胞类型的鉴定。...

基于三维定量相位成像与机器学习的无标记淋巴细胞亚型识别

本文介绍的实验方案可在体内炎症条件下表征人原代淋巴细胞的肺部归巢能力。在过敏性炎症小鼠模型中，通过化学透明化处理肺组织后，利用光片荧光显微镜对过继转移的人免疫细胞在肺部的浸润情况进行成像并定量分析。...

基于光片显微镜的过敏性炎症活体实验模型中肺归巢人淋巴细胞的高级成像

本实验方案的目的是展示如何利用晶格光片显微镜对活细胞中表面受体的动力学过程进行四维可视化观察。此处展示的是CD4+原代T细胞上的T细胞受体。...

使用晶格光片显微镜四维可视化T细胞受体表面动力学

本方案详细描述了如何构建单物镜光片荧光显微镜，并用于观察细胞骨架网络。...

可定制单物镜光片荧光显微镜的设计与构建用于细胞骨架网络的可视化

了解光片显微术在三维胶原基质中可视化人体免疫细胞的方法。该技术可实现快速成像并减少光毒性，用于追踪细胞迁移模式，为免疫学和细胞生物学研究提供重要工具。

光片显微镜用于人免疫细胞的三维可视化

探索更多视频