三维人体免疫细胞可视化的光片显微术

这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如免疫细胞在生理相关环境中的具体行为，例如如何在三维环境中有效地搜索目标细胞。这种方法的主要优点是产生非常薄的光片，仅照亮焦平面，而不影响平面外单元。这实现了非常快的采集速度，并显著降低了漂白和光细胞毒性。

演示此程序的是我实验室的博士后 Renping Zhao 博士。首先，在细胞培养罩下，将 400 微升冷冻胶原蛋白原液转移到无菌 1.5 毫升试管中。缓慢加入 50 μL 冷冻的 10X PBS。

然后通过轻轻倾斜试管来混合溶液。向胶原蛋白溶液中加入 48 微升 0.1 摩尔氢氧化钠，将 pH 值调节至 7.2 至 7.6。使用 pH 试纸测定混合物的 pH 值。

加入 2 μL 无菌蒸馏去离子水，使最终体积达到 500 μL。充分混合并将胶原蛋白溶液储存在冰上或 4 摄氏度，以备进一步使用。根据文本方案荧光标记活细胞后，在细胞培养罩下，将 1 乘以 10 至第六个细胞转移到无菌 1.5 毫升管中。

以 200 倍 g 离心管 8 分钟。然后弃去上清液，使用 200 微升培养基重悬沉淀。将 85.9 微升中和的胶原蛋白溶液添加到细胞悬液中并适当混合，以达到每毫升 2.5 毫克的胶原蛋白浓度。

将细胞胶原蛋白混合物放在通风橱中的冰上。接下来，将柱塞插入匹配的毛细管中，直到柱塞从毛细管中伸出 1 毫米。然后浸入培养基中润湿柱塞。

跳过此步骤可能会导致在柱塞和胶原蛋白基质之间意外引入气泡。将毛细管浸入细胞胶原蛋白混合物中，然后慢慢将柱塞向后拉 10 至 20 毫米。然后用 70% 乙醇喷雾瓶，湿润纸巾，用它擦拭毛细血管外壁，以去除残留的胶原蛋白溶液。

现在使用建模粘土将毛细管安装到 5 毫升试管的内壁上。将细胞胶原蛋白混合物推至毛细管边缘。然后将试管与毛细管在 37 摄氏度和 5%CO2 下孵育 1 小时，以聚合胶原蛋白。

孵育后，向试管中加入 1 至 2 mL 培养基。然后小心地将聚合的胶原蛋白棒排出到培养基中，直到大约一半的胶原蛋白悬挂在培养基中。将毛细管再孵育 30 分钟。

要进行光片显微镜检查，请根据制造商的说明组装样品室。如果进行实时成像，则打开显微镜和培养箱后，将毛细管放入样品室中，找到样品，并找到感兴趣的图像采集区域。激活相应的激光。

然后设置激光功率和曝光时间。此外，设置 Z 堆栈的步长、Z 堆栈的开始和结束位置以及活细胞成像的时间间隔。然后开始图像采集。

将 1 毫升 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液转移到化学罩下的 5 毫升试管中。然后将带有聚合胶原蛋白的毛细管浸入多聚甲醛溶液中，并使用造型粘土将毛细管安装在管的内壁上。轻轻按压柱塞，直到胶原蛋白棒的一半悬挂在多聚甲醛溶液中。

然后拉回柱塞，将胶原蛋白棒带回毛细管中。从试管中取出毛细管并丢弃多聚甲醛。将毛细管安装到新试管中，并加入 1 毫升 PBS。

确保毛细管浸入 PBS 中。轻轻按压柱塞，直到胶原蛋白棒的一半悬挂在溶液中，然后孵育 5 分钟。拉回柱塞以吸收毛细管中的胶原蛋白棒。

然后用新鲜的 PBS 替换 PBS，并将胶原棒排出到溶液中。第三次洗涤后，向试管中加入 1 至 2 mL 封闭透化缓冲液。将胶原棒排出到溶液中，并在室温下孵育试管 30 至 60 分钟。

在封闭透化缓冲液中用 200 至 500 μL 一抗替换封闭透化缓冲液，并将浸没的胶原棒在溶液中孵育 1 小时。使用 PBST 洗涤胶原棒 3 次后，在室温下将胶原棒在封闭透化缓冲液中的二抗中孵育 1 小时。在 PBS 中再洗涤 3 次后，将胶原棒拉回毛细管中，并将样品保持在 PBS 中直至成像。

如这部电影所示，在迁移过程中，转染 EGFP 肌动蛋白融合蛋白的 CTL 细胞形成柠檬状的主要突起，边缘是细小的纺锤体状结构。CTL 的轨迹在此处以速度和持久性或位移除以总轨道长度作为测量参数来说明。速度范围为每秒 0.01 至 0.19 微米，差异近 20 倍，持久性范围为 0 至 0.7。

该图显示了 3D 胶原凝胶中固定的 CTL 细胞，内源性穿孔素-1 和肌动蛋白染色。样品从单侧或两侧照射。从不同的 Z 位置，细胞被均匀染色，表明抗体很好地渗透到胶原蛋白凝胶中。

固定 CTL 表现出与活细胞相同的形态，表明该方案很好地维持了形态。在尝试此过程时，请务必记住避免气泡并正确调整 pH 值。在此程序之后，可以执行其他方法，例如使用特定表面分子进行活细胞染色，以回答其他问题，例如如何将细胞行为与分化或不同细胞亚型相关联，或研究细胞间相互作用和细胞命运。

开发后，这项技术为细胞生物学、免疫学和癌症研究领域的研究人员铺平了道路，以探索体外最具生理相关性的系统中的细胞行为、细胞命运、分化和细胞相互作用。观看本视频后，您应该对如何制备细胞嵌入三维胶原蛋白基质的样品、如何使用光片显微镜（实时或固定）可视化样品，以及如何在 3D 中跟踪细胞迁移有了很好的了解。