评估自然杀伤细胞对癌细胞的细胞毒性的体外测定

取一个含有自然杀伤或 NK 细胞和癌细胞的多孔板。对照井仅含有癌细胞。

心机以促进细胞接触。

孵化。NK细胞上的激活受体与癌细胞表面配体结合，触发NK细胞释放含有细胞毒性分子的颗粒。

这些分子产生癌细胞膜孔并诱导细胞死亡，释放细胞内内容物，包括乳酸脱氢酶或 LDH。

添加洗涤剂以裂解对照孔中的癌细胞，以最大限度地释放 LDH。

心并将一部分含LDH的上清液转移到测定板中。

加入测定试剂并孵育。

LDH 将乳酸转化为丙酮酸，还原 NAD+。发汗酶利用NADH还原四唑盐，形成红色的甲臜产物。

加入酸性溶液以停止酶促反应。

使用酶标仪测量孔中的甲臜吸光度。

甲臜强度与测试孔中裂解的癌细胞数量成正比，表明NK细胞对癌细胞的细胞毒性。

首先，获得圆底培养处理的96孔板，并按照文本方案的表1中概述进行设置。将测定板以250倍g离心4分钟，以确保效应器和靶细胞接触。接下来，将板在37摄氏度的加湿室中与5%二氧化碳孵育5小时。

收获上清液前 45 分钟，将 10 微升 10x 裂解溶液加入靶细胞最大 LDH 释放孔中，并将板放回加湿室。孵育完成后，将板以250倍g离心4分钟。然后，使用多通道移液器将 50 微升等分试样从每个孔转移到新鲜的 96 孔平底测定板中。

向测定板的每个孔中加入 50 微升测定试剂。用箔纸盖住板以避光，并在室温下孵育 30 分钟。之后，向每个孔中加入 50 微升终止溶液。确保在添加终止溶液后 1 小时内读取板并记录 490 纳米处的吸光度。