使用亲和层析纯化自组装蛋白质纳米颗粒

组自组装蛋白质纳米颗粒的工程细菌悬浮液，带有多组氨酸标签。

超声处理以释放细胞内成分。

心以收集含有蛋白质纳米颗粒的上清液。用不含咪唑的缓冲液稀释。

脂糖珠和固定化镍阳离子的亲和色谱柱。

加入咪唑浓度低的缓冲液以进行色谱柱平衡。

将细菌裂解物添加到色谱柱上。

运行过程中，蛋白质纳米颗粒上的多组氨酸与镍阳离子强结合。

同时，细菌脂多糖和其他蛋白质等污染物与色谱柱的结合较弱。

用含有低咪唑浓度的缓冲液洗涤，以去除弱结合的蛋白质。

引入异丙醇去除脂多糖，然后洗涤。

接下来，引入咪唑浓度中等的缓冲液。咪唑与组氨酸竞争与镍阳离子的结合，释放结合的蛋白质纳米颗粒。

接下来，加入含有高咪唑浓度的缓冲液以完全洗脱蛋白质纳米颗粒。

收集纯化的蛋白质纳米颗粒以供进一步应用。

对于表达六螺旋束SAPN的收获的大肠杆菌的裂解，使用超声输出为150瓦的探针，超声处理4秒，静置6秒，将重悬的细菌沉淀在40毫升不含咪唑的缓冲液中超声处理5分钟。

心细胞裂解物以产生澄清的上清液，并将上清液转移到无菌的 150 毫升烧瓶中。然后，用新鲜的不含咪唑的缓冲液将样品带到100毫升的最终体积

要分离感兴趣的蛋白质，请打开FPLC软件并单击"新建方法"选项。在 方法 设置（Method Settings） 菜单中，打开 色谱柱位置（Column Position） 下拉菜单，然后选择 C1 端口 3（C1 端口 3）。在 显示依技术（Shown By Technique） 下拉菜单中，选择 亲和性（Affinity）。在"列类型"下拉菜单中，选择"其他"、"HisTrap HP"和"五毫升"。色谱柱体积和压力箱将自动设置为适当的值。

单击"方法大纲"，然后从箭头旁边的"相库"弹出菜单中拖动"平衡"和"样品应用"按钮、三个"色谱柱清洗"按钮和"洗脱"按钮，然后关闭"相库"菜单。单击平衡，将表中列出的值设置为初始缓冲液 B，4%，最终缓冲液 B，4% 和色谱柱体积，5。

单击示例应用程序。在"样品上样"框中，单击"使用样品泵在色谱柱上进样样品"的单选按钮，并确认在"样品进样"中选中了"使用方法设置的流速"旁边的框 带系统泵箱。将"体积"框值更改为 100 毫升，并将"馏分收集方案"更改为"启用"。

取消单击"从方法设置中使用馏分大小"框，并将馏分大小更改为 4 毫升。单击第一个色谱柱清洗按钮。将表中列出的值设置为初始缓冲液 B，4%，最终缓冲液 B，4% 和色谱柱体积，10。单击"馏分收集方案启用"框，然后取消单击"将馏分大小用于方法设置"。将馏分大小更改为 4 毫升，然后单击第二个色谱柱清洗按钮。

将表中的值设置为初始缓冲液 B，0%，最终缓冲液 B，0% 和色谱柱体积，5。单击"馏分收集方案启用"框，然后取消单击"方法设置"中的"使用馏分大小"。将馏分大小更改为 4 毫升，然后单击"第三列清洗"按钮。将表中的值设置为初始缓冲液 B，0%，最终缓冲液 B，0% 和色谱柱体积，10。单击"馏分收集方案启用"按钮，然后取消单击"将馏分大小用于方法设置"框。然后，将馏分大小更改为 4 毫升。

单击洗脱按钮，然后右键单击表中的信息。在弹出菜单中，单击"删除步骤"，然后将"等度渐变"按钮拖动到表格上两次，以便有两个条目。将第一个条目的值设置为初始缓冲液 B，30%，最终缓冲液 B，30%，色谱柱体积，10。

将第二个条目的值设置为初始缓冲液 B，100%，最终缓冲液 B，100%，色谱柱体积 10。单击"馏分收集方案启用"按钮，然后单击"将馏分大小用于方法设置"框。然后，单击"另存为"并将文件命名为"纯化"。

将FPLC的泵A管放入不含咪唑的洗涤缓冲液中，将泵B管放入500毫摩尔咪唑缓冲液中。将样品泵管放入 100 毫升样品中并运行纯化程序。当需要 60% 异丙醇清洗时，暂停程序，将泵管从不含咪唑的清洗液移至 60% 异丙醇清洗液中，然后重新启动程序。洗涤结束时，再次暂停程序，将泵A管返回到不含咪唑的洗涤缓冲液中，然后重新启动纯化程序。