12-Dithiolane 改性自组装肽的合成与表征

随着增加超分子结构功能的结构的增长，这种将 1， 2-二硫代烷基团与自组装肽结合的方法可以帮助回答有关超分子表面反应性的关键问题。该技术的主要优点是 1， 2-二硫代烷前体分子的偶联和脱保护发生在树脂上，只需对最终修饰的肽进行一次纯化。由于组装体成熟为最终超分子结构所需的时间各不相同，因此超分子组装体的表征方法和结果的可视化演示至关重要。

为了合成二硫环前体，首先将 1 克 3-溴-2-丙氨酸溶解在大约 4 毫升的 1 摩尔氢氧化钠中，置于 50 毫升圆底反应瓶中，在 55 摄氏度下搅拌。当所有试剂都悬浮在溶液中后，用隔垫密封反应瓶，并将培养瓶置于氮气气氛中。接下来，将 1.49 克硫代乙酸钾和三毫升二摩尔硫酸加入 4 毫升去离子水中，原位生成硫代乙酸。

将硫代乙酸溶液吸出到一次性塑料 10 毫升注射器中，并在注射器上配备 18 号针头，然后用针头刺穿隔垫，将混合物滴加到反应瓶中，并在 55 摄氏度下继续反应过夜。第二天早上，使用甲醇和二氯甲烷的混合物在硅胶 60 F254 板上通过薄层色谱监测反应，并通过溴甲酚绿染色观察反应进程。当完成的反应冷却至室温时，用两摩尔硫酸将混合物酸化至 pH 值为 1。

应从溶液中分离出黄色油，然后用三个 40 毫升的冷氯仿提取产品，并将有机层合并以在硫酸镁上干燥，减压去除氯仿。产品应为总收率为 83% 的黄油，无需进一步提纯即可使用。为了将二硫环前体偶联到树脂上肽的 N 端，将 4 个当量的二硫环前体添加到 5 毫升二甲基甲酰胺、4 个当量的 HBTU 和 10 个当量的 DIPEA 中。

让偶联混合物在室温下预活化 10 分钟，然后将样品添加到含 N 端树脂的烧结注射器中。摇动偶联反应物 2 小时，然后在新鲜的二甲基甲酰胺中洗涤 3 次 5 mL，重复偶联反应并振荡过夜。第二次偶联后，用 3 次 5 mL 二甲基甲酰胺洗涤液洗涤树脂，然后用 3 次 5 mL 二氯甲烷树脂洗涤液洗涤树脂，并将干燥的树脂转移到 10 mL 微波反应管中。

然后，为了从 N 端二硫代烷前体中脱保护硫代乙酸酯基团，向试管中加入 2 毫升二甲基甲酰胺。让树脂膨胀，在容器中加入一个小的磁力搅拌棒，然后用低速磁力搅拌重悬树脂。15 分钟后，向试管中加入 2 毫升浓氢氧化铵，用硅胶隔垫封盖反应容器，然后将容器放入微波反应器中，在 75 摄氏度下搅拌 45 分钟。

微波反应完成后，将树脂转移到干净的一次性烧结注射器中，并用两次 5 mL 二甲基甲酰胺和两次 5 mL 甲醇清洗液清洗树脂。最后一次洗涤后，向含树脂的注射器中加入 5 mL 裂解混合物，在室温下轻轻摇动孵育 1 1/2 小时。要制备 1 毫升用于高效液相色谱或 HPLC 纯化的粗肽，将 400 μL 浓缩肽原液的乙腈溶液加入 600 μL 补充有 0.1% 三氟乙酸的水中，并通过 22 μm 针式过滤器将溶液过滤到 HPLC 样品瓶中。

要纯化肽，使用 C18 半制备柱，以每分钟 3 mL/min 的流速在 20 分钟内以 15% 至 55% 乙腈的线性梯度，UV 检测器设置为 222 nm 和 330 nm。然后收集并组合感兴趣的峰。对于通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间或 MALDI-TOF 质谱法确认肽产物，将 0.5 微升收集的峰混合在含有 0.5 微升 2,5-二羟基苯甲酸基质的基质辅助激光解吸/电离板上。

要制备自组装溶液，请将 1 毫克冻干肽粉末溶解在 1.5 mL 微量离心管中的 20% 乙腈和 10 毫摩尔 HEPES 混合物中，然后涡旋组装溶液，让样品在室温下组装。当肽组装体达到成熟时，将 8 至 10 微升组装溶液作为薄膜干燥在衰减的全反射金刚石晶体上，并监测干膜形成时 1640 至 1631 平方厘米的大而宽的水峰的消失。采集 1500 至 1800 平方厘米倒数厘米的背景和红外光谱，平均 50 次扫描，分辨率为 2 平方厘米，在每次样品扫描前减去背景扫描。

β 片组装的红外特征应观察为 1625 和 1635 倒厘米之间的尖峰。当肽样品成熟为富含 β 折叠的超分子结构时，将 10 微升肽组装溶液加载到透射电子显微镜碳网格的表面上，并让组装体吸附到网格表面 1 到 2 分钟。将滤纸接触网格边缘以去除多余的样品，并将 10 微升新鲜制备的 2% 乙酸铀酰染色剂添加到网格表面孵育 2 至 3 分钟，然后用滤纸去除多余的染色剂，并将网格放入真空干燥器中过夜，然后第二天通过透射电子显微镜成像。

除了二硫环前体分子的初始一步合成外，其余的 1， 2-二硫环修饰的肽合成发生在固体载体上。3-溴-2-丙酸转化为 3-2-丙酸（二硫环前体）是通过质子和碳 13 核磁共振确认的，然后它与仍在树脂上的肽的游离 N 端胺偶联。脱保护后，粗肽通过反相 HPLC 纯化，并通过 MALDI-TOF 质谱法确认产物的质量。

傅里叶变换红外和圆二色谱光谱可用于监测纯化的 1， 2-二硫代烷肽自组装成成熟的淀粉样蛋白纤维，以表征其延伸的 β 折叠构象。然后可以通过透射电子显微镜对纤维进行成像。虽然这些方法可用于修饰仍在填料上的任何肽序列的 N 端，但重要的是要记住，应针对每种肽优化肽自组装条件。

这些技术将 1,2-二硫代烷基团添加到自组装肽中，将使生物材料领域的研究人员能够探索超分子表面反应性。