通过同步光刺激和视频录制评估功能性神经肌肉接头

从生物反应器开始，该反应器有一个肌肉室，其中包含支撑在腔室柱上的胶原蛋白嵌入的肌肉组织。

神经球通道包含胶原基质中的神经球。神经球的运动神经元表达光敏通道。

添加含有神经生长因子的分化培养基，刺激神经元扩展其投射。

定期更换培养基，确保神经元持续向肌肉组织延伸，形成神经肌肉接头。

在配备相机和蓝色光源的显微镜下观察生物反应器。

应用蓝光脉冲打开神经元中的光敏通道，使介质中的离子流动并刺激神经元产生电信号。

这些信号通过神经元投射传播到神经肌肉接头，将电信号传输到肌肉组织。

同时录制视频。肌纤维的逐渐收缩证实了功能性神经肌肉接头的发展。

制备每毫升 3 毫克胶原蛋白 I 和溶解基底膜基质的 4 比 1 混合物。然后，将成肌细胞重悬于这种新鲜制备的胶原蛋白混合物中。

接下来，将 15 微升这种细胞胶原蛋白悬浮液添加到生物反应器的每个肌肉室中，确保使用移液器吸头将悬浮液分布在两个柱子上。让细胞凝胶混合物在 37 摄氏度下聚合 30 分钟。然后，用 450 微升强直生长培养基填充每个生物反应器孔。

在运动神经元分化的第 11 天，将细胞和培养基转移到 50 毫升管中，并让神经球沉降到底部 5 分钟。吸出上清液并将细胞重悬于15毫升运动神经元悬浮培养基中，该培养基补充有每毫升20纳克的脑源性神经营养因子和每毫升10纳克的神经胶质细胞源性神经营养因子。

在分化方案的第 14 天，将运动神经元接种到平台中。制备每毫升 2 毫克胶原蛋白 I 和溶解基底膜基质的 4 比 1 凝胶混合物。使用400纳米细胞过滤器选择大的神经球，并将它们重悬于制备的凝胶混合物中。

小心地，从储液器和神经球中吸出培养基。然后，将 15 微升凝胶混合物添加到神经球通道中。将 10 微升移液器装入 10 微升凝胶，然后选择一个神经球。将神经球沉积到神经球通道中，确保它在腔室中。然后，缓慢抬起移液器，同时在神经球沉积后释放剩余的凝胶。

让凝胶在 37 摄氏度下聚合 30 分钟。然后，向储液器中加入 450 微升 NbActiv4，补充有每毫升 20 纳克脑源性神经营养因子和每毫升 10 纳克神经胶质细胞源性神经营养因子。

对于成像，使用倒置荧光显微镜和科学互补金属氧化物半导体相机软件。将合并设置为 2 x 2，曝光设置为 20 毫秒，打开卷帘快门，读出速率设置为 540 兆赫兹，动态范围设置为 12 位和增益 1，传感器模式重叠。在显微镜上使用2倍物镜对微组织进行成像，并将活细胞室连接到显微镜载物台上。

选择包含受支配骨骼组织的感兴趣区域，以最大限度地减少文件大小和处理时间。然后，在样品和成像物镜之间放置一个 594 纳米长通发射滤光片，以滤除来自相机的蓝光脉冲。接下来，将包含四个生物反应器的矩形四孔板放入活细胞室中。然后，单击实时取景，居中，并以所需的 ROI 聚焦图像。

从 GitHub 文件夹下载自定义宏代码以控制舞台位置、Arduino 板和视频采集。然后，将输出电影设置为day_tissuegroup_tissuename_experiment。ND2.在舞台上设置所需的 x 和 y 坐标运行宏代码，并以每秒 50 帧的速度获得 1,700 帧的快速延时延时摄影。

成像后，更换培养基并将样品返回培养箱。在图像采集会话之间至少留出 24 小时，以避免组织疲劳。