Name: 测量神经肌肉接头功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学习使用离体肌肉神经制备技术评估神经肌肉接头功能，通过直接刺激与神经刺激比较收缩反应差异。该方法适用于研究神经肌肉疾病中的信号传递机制。

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作者实验室的工作得到了罗马基金会和特莱顿基金会（资助编号：GGP14066）的支持。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

上述实验方案为检测和区分肌肉本身直接发生或神经肌肉接头水平间接发生的功能改变提供了一种理想方法。由于该技术基于对神经肌肉接头功能的间接测量，因此无法用于确定任何功能缺陷是否与形态学变化或生物化学变化相关。然而，该方法能够有效判断任何形态学或生物化学改变是否导致了神经传递信号功能的下降。在完成力学测量后，可将肌肉从浴槽中取出，吸干，固定于最佳长度，周围包埋于包埋剂中，并在融化的异戊烷中快速冷冻。肌肉样品可在 -80 °C 下保存，以备后续进行免疫组织化学和形态学分析等评估。
本文提出的实验技术基于一种测试方案，该方案首次结合了对表征神经肌肉接头（NMJ）和肌肉功能的多个参数的测量。三个关键要点确保了该技术能够获得可靠的结果。
首先，尽管骨骼肌切除现在是一种相对常见的技术，但在进行手术操作时必须格外小心，以确保神经与肌肉保持完整连接。因此，在尝试任何其他实验模型之前，应先在对照小鼠上检验操作者的技术水平。在对照小鼠中，肌肉对直接刺激和间接刺激的收缩反应应相同，从而为操作者的手术能力提供对照依据。
<p class="jov...

神经肌肉接头（NMJ）是由肌纤维的运动终板与运动神经元轴突末梢连接形成的化学突触。研究表明，当肌肉与神经之间的通信受损时（如在衰老或肌萎缩侧索硬化症（ALS）中），NMJ发挥着关键作用。由于肌肉与神经之间存在双向通信1,2，能够将NMJ功能障碍与肌肉本身缺陷区分开来单独测量，可能有助于深入理解二者之间的病理生理相互作用。事实上，这种功能评估有助于判断形态学或生物化学的改变是否导致了神经传递信号功能的下降。
通过比较神经刺激引发的肌肉收缩反应与直接刺激同一肌肉膜所引发的收缩反应，已被提出作为神经肌肉接头（NMJ）功能的间接测量方法。事实上，由于膜刺激绕过了神经递质传递信号，因此两种收缩反应之间的任何差异均可归因于神经肌肉接头的变化。该方法已在大鼠中被广泛采用3,4,5,6,7，并同样用于获取小鼠模型的相关信息8,9,10,11,12。
在此，我们详细描述了一种切除并检测两种肌肉-神经标本的实验方法，即比目鱼肌-坐骨神经标本和膈肌-膈神经标本。使用定制的 软件，我们设计了一种连续测试方案，该方案结合了多个参数的测量，用以表征神经肌肉接头（NMJ）和肌肉功能，从而能够将NMJ损伤与肌肉损伤分别进行综合评估。具体而言，该方案测量了肌肉单收缩力、肌肉动力学参数、直接刺激与神经刺激下的力-频率曲线以及神经传递衰竭情况13 对于单次放电频率和强直性频率，以及阵内疲劳7.

<table><tbody><tr><td>双模式杠杆系统&amp;nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>300B</td><td>驱动器/传感器</td></tr><tr><td>高功率双相刺激器&amp;nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>701B</td><td>脉冲刺激器（神经）</td></tr><tr><td>高功率双相刺激器&amp;nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>701C</td><td>脉冲刺激器（肌肉）</td></tr><tr><td>离体肌肉实验装置&amp;nbsp;</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>800A</td><td></td></tr><tr><td>组织预处理浴槽</td><td>Radnoti</td><td>158400</td><td></td></tr><tr><td>单极吸引电极</td><td>A-M Systems</td><td>573000</td><td>配自制参考电极&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>示波器&amp;nbsp;</td><td>Tektronix</td><td>TDS2014</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Nikon</td><td>SMZ 800</td><td></td></tr><tr><td>冷光源照明器&amp;nbsp;</td><td>Photonic Optics</td><td>PL 3000</td><td></td></tr><tr><td>数据采集板</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6353</td><td></td></tr><tr><td>连接器模块</td><td>National Instruments</td><td>NI 2110</td><td></td></tr><tr><td>个人计算机</td><td>AMD Phenom II x4 970</td><td></td><td>处理器 3.50 GHz，搭载 Windows 7 操作系统</td></tr><tr><td>LabView 2012 软件</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Ringer 碳酸氢盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002&amp;nbsp;</td><td>生理缓冲液</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>无水，粉末，&amp;ge;97%</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>&amp;ge;99.5%（滴定法）</td></tr><tr><td>培养皿 60 mm × 15 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>聚苯乙烯</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Sylgard&amp;nbsp;</td><td>184 硅胶&amp;nbsp;</td><td>弹性体套件&amp;nbsp; 0.5 kg</td></tr><tr><td>恒温器</td><td>Dennerle</td><td>DigitalDuomat 1200</td><td></td></tr><tr><td>泵</td><td>Newa Mini</td><td>MN 606</td><td>用于水族箱</td></tr><tr><td>耐热温控电缆</td><td>Lucky Reptile</td><td>61403-1</td><td>50/60 Hz 50 W</td></tr><tr><td>桶</td><td>任意 10 升</td><td></td><td>聚丙烯</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; + 5%CO2</td><td>siad</td><td></td><td>混合气体</td></tr><tr><td>#5 镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>2 件</td></tr><tr><td>弹簧剪刀 - 8 mm 刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td>神经切除</td></tr><tr><td>锐利剪刀&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>14059-11</td><td>肌肉剥离</td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Wagner</td><td>02.06.32</td><td>动物体表操作</td></tr><tr><td>学生型手术刀柄 #3</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>91003-12&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #10</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片 #11</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>尼龙丝 &amp;Oslash;0.16 mm</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

测量神经肌肉接头功能

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

在研究运动神经元与肌肉之间通信功能受损的疾病（如衰老和肌萎缩侧索硬化症，ALS）时，神经肌肉接头（NMJ）的功能起着关键作用。本文介绍了一种实验方案，可通过结合两种类型的电刺激——直接肌肉膜刺激和通过神经的刺激——来评估NMJ功能。比较肌肉对这两种不同刺激的反应，有助于在功能层面上明确NMJ中可能导致肌肉功能下降的潜在改变。
E离体 制备样品适用于严格控制的研究。本文介绍了一种用于腓肠肌-坐骨神经制备和膈肌-膈神经制备的强化方案，以测量肌肉及神经肌肉接头（NMJ）功能的多个参数。该方案持续约60分钟，通过定制装置不间断地进行。 用于测量肌肉收缩动力学特性、肌肉与神经刺激下的力-频率关系，以及神经肌肉接头（NMJ）功能特异性的两个参数，即神经传递衰竭和串内疲劳的软件。该方法学被用于通过 SOD1 检测腓肠肌和膈肌肌肉-神经标本的损伤情况G93A 转基因小鼠，一种ALS的实验模型，该模型普遍过表达突变的抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）。

本方案可提供关于多种神经肌肉疾病或衰老相关肌肉减少症中功能性去神经支配的信息。该方案可用于确定肌肉的改变是否由肌肉本身或神经肌肉传递过程中的选择性变化引起，以及（若存在）发生在哪个层面。下图所示数据来自我们课题组此前的一项研究18，研究对象为肌萎缩侧索硬化症（ALS）的SOD1G93A转基因小鼠模型，在疾病终末期进行检测20。SOD1G93A转基因小鼠全身性地过表达突变型抗氧化酶超氧化物歧化酶1（SOD1）。图3和图4分别展示了比目鱼肌-坐骨神经（左）和膈肌-膈神经（右）标本的dF/dt值和强直收缩力值。这些结果表明，本研究所提出的技术能够区分转基因肌肉中与神经肌肉接头（NMJ）相关的功能缺陷和仅与肌肉本身相关的功能缺陷。事实上，无论是dF/dt还是强直收缩力，SOD1G93A比目鱼肌在直接刺激时的收缩反应均低于对照组肌肉，而通过神经刺激时则进一步降低。相比之下，当膈肌条通过膜直接刺激时，这两项参数仅表现出轻微改...

神经肌肉接头（NMJ）的功能评估可提供有关肌肉与神经之间通信的关键信息。本文介绍了一种利用两种不同的肌肉-神经标本——即比目鱼肌-坐骨神经和膈肌-膈神经——全面评估NMJ及肌肉功能的实验方案。

神经肌肉接头（NMJ）功能在研究运动神经元与肌肉之间通信受损的疾病中起着关键作用。

本实验的总体目标是通过离体实验方法研究神经肌肉接头的功能。该目标通过两种方式刺激肌肉神经制备来实现：直接刺激肌膜以及通过神经进行刺激。由于膜刺激绕过了神经传导信号，因此两种收缩反应之间的任何差异均可被视为神经肌肉接头功能的间接测量指标。本文介绍了比目鱼肌坐骨神经标本的实验方法。将肌肉连同其神经一起解剖，并置于灌流的组织浴槽中。肌肉一端固定于力与长度控制器上，一对铂电极则平行放置于肌肉两侧。将玻璃吸电极移至神经切断端附近。随后应用全面的测试方案，以充分评估神经肌肉接头和肌肉的功能。肌肉与神经之间的功能性连接对于两部分存活组织均得出结论。在每个组织水平的第一区域内，两种组织相互沟通形成神经肌肉接头，其通常呈现类似终板的形态结构。然而，在多种病理状态下，肌肉与神经之间的功能相互作用会严重受损，导致神经肌肉接头失去复杂的形态学结构。本实验方案的总体目标是通过体外实验方法研究神经肌肉接头的功能特性。通过两种方式刺激肌肉神经标本来实现这一过程：一种是直接刺激肌肉膜，另一种是刺激神经并分析肌肉特性。打开循环水浴并调节温度至30摄氏度。用克雷布斯-林格溶液填充浴槽。使0.4 bar的气体混合物通过氧管并通入浴槽中。打开驱动器换能器和两个脉冲刺激器。将膜刺激的电流值设为3亿对，神经刺激的电流值设为500万对。通过颈椎脱位处死小鼠后，去除腿部皮肤。剪断跟腱，同时紧夹跟腱并向上牵拉腓肠肌和比目鱼肌。暴露腓肠肌近端肌腱后，将其上方整个小腿部分切断，并迅速将样本置于体视显微镜下的预备组织浴槽中。使用一对镊子牢固夹住腓肠肌的近端肌腱，轻轻牵拉以暴露坐骨神经支配区域。一旦暴露神经支配区域，清除周围组织，露出约五毫米的神经。然后使用精细的剪刀小心地切断神经。通过切断跟腱以分离比目鱼肌与腓肠肌，完成肌肉和神经的切除。此时，肌肉神经标本已准备好安装至测试装置上。在尼龙线末端打一个活结，并将其扎紧在跟腱周围。将肌腱近端固定在固定夹中，并将尼龙线系在力传感器的杠杆臂上。让肌肉在溶液中平衡一段时间。为确定初始最佳长度，通过一系列单脉冲刺激肌肉，同时轻微调节蠕变负载值。当抽搐力达到最大值时，即获得最佳长度。将吸吮电极置于肌肉附近，并将神经轻轻吸入。然后，在轻柔调节脉冲电流值的同时，用一系列单脉冲刺激肌肉。通过神经刺激所引发的肌肉收缩力应与直接在肌膜上刺激时测得的数值相等。确定最佳电流值后，将神经推出电极，并施加数个电流脉冲。如果先前选择的电流过大，通过吸电极传递的电流脉冲会经由浴液传导电流，从而引发肌肉收缩。我们利用自行开发的软件设计了一种自动测试方案，用于研究比目鱼肌神经肌肉接头的功能。该方案持续约65分钟，由四个不同部分组成。在第一部分中，使用四个单脉冲刺激肌肉，其中两个直接施加于肌肉，另两个通过神经传递。随后从收缩反应中测量达到峰值的时间、半松弛时间、力导数的最大值以及单收缩力。在第二部分中，使用一系列频率从 20 赫兹到 80 赫兹的脉冲串刺激肌肉，该频率范围为强直收缩频率。通过计算神经刺激和直接刺激的力-频率曲线来分析肌肉收缩力。在实验方案的第三和第四部分，肌肉将接受两种疲劳范式处理，以测量神经传导衰竭和强直间疲劳。在这些疲劳实验范式中，肌肉持续受到刺激，每次先在肌膜上施加一个脉冲序列，随后通过神经施加14个脉冲序列。整个序列重复20次。第一个范式以35赫兹的放电频率进行。在80赫兹的强直频率下进行第二次刺激。神经传导衰竭被认为在疲劳的发生过程中起着重要作用，因为它与动作电位传导的外部阻滞、递质释放减少以及接头后膜兴奋性降低和终板疲劳能力下降相关。神经肌肉接头疲劳能力的另一个方面明显表现为单次强直收缩过程中的收缩内疲劳，这是对肌肉在单次强直收缩期间维持力量能力的评估，反映了高频疲劳。 在实验方案结束时，使用模拟卡尺和精密天平测量肌肉的净长度和重量，以计算肌肉的横截面积。对肌萎缩侧索硬化症的 SOD1 转基因小鼠模型的研究突显了该方法的潜力。事实上，转基因小鼠的比目鱼肌在直接刺激时，其收缩反应（包括力导数和强直收缩力）均降低，而在通过神经刺激时，这种降低更为显著。以强直收缩力为例，这些实验表明，肌肉收缩性占损伤的25%，而另外45%与神经传导缺陷有关。另一个有趣的发现是，在直接或间接刺激时，对照组肌肉未表现出任何差异。该结果证明，该方法不会引入任何技术性假象，因为在对照动物中，神经肌肉接头应完全正常发挥功能。关于强直性收缩期间的疲劳，结果显示转基因比目鱼肌的数值显著低于对照组。有趣的是，转基因比目鱼肌在重复刺激下会受到显著损伤，这意味着神经肌肉接头功能的评估最多只能在八分钟的刺激时间内进行。八分钟后，当受到刺激时，转基因肌肉的收缩力几乎降至零。观看视频后，您应该已经了解如何测量小鼠神经肌肉接头功能及比目鱼肌的功能。由于该技术基于对神经肌肉接头功能的间接测量，因此无法判断所观察到的功能缺陷是否与形态学或生物化学改变相关。另一方面，该方法对于评估这些损伤是否影响神经信号传递的正常功能具有重要意义。最后，该方案可轻松应用于检测膈肌神经肌肉接头的功能，而膈肌是另一种常受病理疾病影响的肌肉。

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本实验方案介绍了一种利用不同生物标志物（即神经丝蛋白200、囊泡乙酰胆碱转运体、α-银环蛇毒素和S100）进行荧光免疫组织化学染色，以检测大鼠腓肠肌内侧头中突触前末梢、突触后受体及突触周施万细胞之间空间相关性的方法。...

可视化大鼠腓肠肌内侧头中神经肌肉接头的形态学特征

本研究展示了一种改进的单纤维肌电图（SFEMG）方案，用于在啮齿类动物模型中实现神经肌肉接头（NMJ）传递功能的体内测量。文中详细描述了SFEMG技术的逐步操作流程，以实现对大鼠腓肠肌中神经肌肉接头传递变异性和传递失败的定量评估。...

刺激性单纤维肌电图（SFEMG）用于评估啮齿类动物模型中神经肌肉接头传递功能

学习使用离体肌肉神经制备技术评估神经肌肉接头功能，通过直接刺激与神经刺激比较收缩反应差异。该方法适用于研究神经肌肉疾病中的信号传递机制。

测量神经肌肉接头功能

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