测量神经肌肉接头功能
August 6th, 2017
（诸多） 神经肌肉接头功能评估可以提供有关肌肉和神经之间的通信的基本信息。在这里，我们描述一项议定书，全面评估的诸多和肌肉功能使用两种不同的肌肉神经制剂，即比目鱼坐骨神经和膈肌膈。
该程序的总体目标是通过离体实验方法研究神经肌肉接头功能。这是通过两种方式刺激肌肉神经准备来实现的，直接在肌肉膜上和通过神经。由于膜刺激绕过了神经传递信号，因此两种收缩反应之间的任何差异都可以被视为神经肌肉接头功能的间接测量。
在这里，我们介绍了比目鱼肌坐骨神经准备中的该程序。将肌肉与其神经一起解剖并放入灌注组织浴中。它固定在力和长度控制器上，一对铂电极平行于肌肉放置。
然后将玻璃抽吸电极移动到神经的切口附近。然后应用全面的测试方案来彻底评估神经肌肉接头和肌肉功能。肌肉和神经之间的功能联系是部分和两个幸存派系的结论。
在两个组织中每个组织水平的第一个区域传达这些神经肌肉接头，它通常显示类似形态的压力。然而，在几种病理条件下，肌肉和神经之间的相互作用的功能受到严重损害，神经肌肉接头失去了复杂的形态学组织。我们程序的总体目标是通过使用离体实验方法研究神经肌肉接头功能。
这是通过以两种方式刺激肌肉神经准备来实现的。一种是通过直接刺激肌肉膜，另一种是通过刺激神经并分析肌肉特性。打开循环水浴，将温度调节到 30 摄氏度。
用 Krebs-Ringer 解决方案填充浴缸。让 O 点 4 bar 的气体混合物流经氧管并进入浴槽。打开致动器换能器和两个脉冲刺激器。
将膜刺激的当前值设置为 3 亿对，将神经刺激的当前值设置为 500 万对。通过颈椎脱臼牺牲小鼠后，去除腿部的皮肤。现在切开跟腱，在紧紧夹住肌腱的同时，将腓肠肌和比目鱼肌向上拉在一起。
一旦比目鱼肌的近端肌腱暴露出来，就切开其上方的整个小腿，并迅速将样品放入位于立体显微镜下的准备组织浴中。用一对镊子紧紧夹住比目鱼肌近端肌腱，轻轻拉动，露出坐骨神经支配。一旦神经支配暴露出来，就去除周围组织，露出大约 5 毫米的神经。
然后用一把细剪刀小心地剪断神经。通过切断跟腱以将比目鱼肌与腓肠肌分开，完成肌肉、神经切除。现在肌肉、神经准备已准备好安装到测试设备上。
在尼龙线的末端打一个滑结，并将其拧紧在跟腱周围。将近端肌腱夹在固定夹内，并将尼龙丝系在力传感器的杠杆臂上。让肌肉在溶液中平衡。
为了确定初始最佳长度，用一系列单脉冲刺激肌肉，同时轻轻改变蠕变载荷值。当抽搐力最大时，可获得最佳长度。将抽吸电极放在肌肉附近并拉入神经。
然后，在轻轻改变脉搏电流值的同时，用一系列单个脉冲刺激肌肉。肌肉通过神经刺激时产生的抽搐力应等于在膜上刺激肌肉时测得的值。确定最佳电流值后，将神经推出电极并传递几个电流脉冲。
如果先前选择的电流量过大，则通过抽吸电极传递的电流脉冲通过浴槽传导电流来引起肌肉收缩。使用自制软件，我们设计了一种用于研究比目鱼神经肌肉接头功能的自动化测试方案。该协议持续约 65 分钟，由四个不同的部分组成。
在第一部分，肌肉受到四个单脉冲的刺激。2 次直接分娩，2 次通过神经分娩。然后根据抽搐响应测量达到峰值的时间、半弛豫时间、力导数的最大值和抽搐力。
在第二部分，肌肉受到一系列从 20 赫兹到 80 赫兹的脉冲序列的刺激，这就是手足风频率。为了计算力，神经刺激和直接刺激的频率曲线。在协议的第三部分和第四部分，肌肉受到两种疲劳范式的影响，以测量神经传递失败和破伤风内疲劳。
在这些疲劳范式中，肌肉受到持续刺激，首先在膜上传递一个脉冲序列，然后通过神经传递 14 个脉冲序列。整个序列重复 20 次。第一个范例以 35 赫兹的发射频率提供。
第二个频率为 80 赫兹的破伤风频率。神经传递失败被认为在疲劳的发展中起着重要作用，因为它与动作电位传播的外部阻滞、递质释放减少以及连接疲劳能力的板兴奋性降低有关。神经肌肉接头疲劳能力的另一个方面清楚地表示为内部疲劳，这是对肌肉在单次破伤风收缩期间保持力量的能力的估计，反映了高频疲劳。
在协议结束时，使用模拟卡尺和精密刻度测量净肌肉长度和重量以计算肌肉横截面积。对肌萎缩侧索硬化症的 SOD1 转基因小鼠模型的研究突出了这种方法的潜力。事实上，当直接刺激时，转基因比目鱼肌对力衍生物和强直力的收缩反应降低，而当通过神经刺激时，收缩反应的减少幅度更大。
例如，就破伤风力而言，这些实验表明，肌肉收缩力占损伤的 25%，而另外 45% 与神经传递缺陷有关。另一个有趣的点是，当直接或间接受到刺激时，控制肌肉没有任何差异。这一发现证明该方法不会诱发任何技术伪影，因为预计神经肌肉接头在对照动物中将完全发挥作用。
关于内部疲劳，结果表明转基因比目鱼肌的值明显低于对照比目鱼肌。有趣的是，转基因比目鱼肌会因重复刺激而显着受损，这意味着可以在最长 8 分钟的刺激时间内评估神经肌肉接头功能。八分钟后，转基因肌肉在受到刺激时恢复到几乎为零的力值。
看完视频后，您应该已经了解如何测量小鼠的神经肌肉接头功能和比目鱼肌。鉴于该技术基于神经肌肉接头功能的间接测量，因此不允许在报告的缺陷与形态学或生化变化有关的情况下进行。另一方面，这种方法代表了评估这些攻击性是否影响神经传递信号的用户功能的重要方法。
最后，该协议提案可以很容易地用于测量隔膜的神经肌肉接头功能，隔膜是另一种经常涉及病理疾病的肌肉。
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概述
本文介绍了一种通过离体肌肉-神经制剂评估神经肌肉接头（NMJ）功能的协议。该研究集中在两种特定制剂上：比目鱼-坐骨神经和横膈膜-膈神经。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肌肉生理学
- 电生理学
背景
- 神经肌肉接头对于神经和肌肉之间的通讯至关重要。
- 了解NMJ功能可以提供各种神经肌肉疾病的洞察。
- 离体制剂允许控制实验条件。
- 直接和间接刺激方法可以揭示肌肉收缩反应的差异。
研究目的
- 使用肌肉-神经制剂评估NMJ功能。
- 比较直接肌肉刺激与神经刺激的收缩反应。
- 为研究NMJ动力学的研究人员提供详细的协议。
使用的方法
- 准备肌肉和神经的解剖。
- 将制剂放置在灌流组织浴中。
- 使用力和长度控制器进行肌肉评估。
- 通过铂电极施加电刺激。
主要结果
- 在直接和神经刺激之间观察到收缩反应的差异。
- 该协议成功展示了NMJ功能评估。
- 结果表明在评估NMJ健康时，刺激方法的重要性。
- 研究结果有助于更好地理解神经肌肉通讯。
结论
- 所描述的协议对于研究NMJ功能有效。
- 了解NMJ动力学对于解决神经肌肉疾病至关重要。
- 未来的研究可以在此方法基础上探索NMJ健康的更多方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Assessing neuromuscular junction (NMJ) functionality is critical for de-risking target validation in neurodegenerative diseases such as ALS, where impaired nerve-to-muscle signaling contributes to functional decline. This ex vivo methodology enables quantitative comparison of direct muscle versus nerve stimulation, providing a functional readout of neurotransmission efficiency that supports mechanistic insight and predictive confidence in early discovery. By isolating NMJ-specific deficits from general muscle contractility, the approach aids in prioritizing targets with stronger translational relevance to human pathology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying NMJ transmission failure as a functional biomarker of pathway integrity.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct comparison of stimulated contractile responses, reducing ambiguity in target mechanism.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by distinguishing compounds that preserve NMJ function from those affecting only muscle contractility.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible force-frequency and twitch kinetics outputs suitable for compound screening campaigns.
- Quantitative Output: Measures neurotransmission failure and intratetanic fatigue as discriminative endpoints for NMJ-specific compound effects.
- Platform Scalability: Adaptable to multiple muscle-nerve preparations (e.g., soleus-sciatic, diaphragm-phrenic), enabling cross-tissue target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly models NMJ dysfunction observed in ALS and aging, supporting translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed deficits stem from neuro transmission failure versus intrinsic muscle pathology, informing target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides functional data to guide go/no-go decisions based on NMJ preservation, reducing late-stage attrition due to unidentified target limitations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early hypothesis testing through functional NMJ assessment before progressing to lead identification and preclinical efficacy studies.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring changes in neurotransmission failure and force-frequency relationships following pathway modulation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts (twitch kinetics, force-frequency curves) that enable reliable compound evaluation across plates and sessions.
- Analytics: Generates normalized metrics of neuro transmission failure and intratetanic fatigue, allowing statistical comparison between treatment and control groups.
- Translational Research: Connects to preclinical validity by modeling human-relevant NMJ decline in SOD1G93A mice, a recognized ALS model.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable functional platform for NMJ assessment across multiple disease models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by isolating NMJ-specific dysfunction from general muscle decline, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated software-controlled protocols and defined stimulation parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of NMJ-liable compounds, preventing investment in targets with poor functional translatability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting targets that preserve NMJ function, aligning with clinical expectations in neurodegenerative indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in ex vivo tissue preparation, electrophysiology, and muscle force measurement techniques.
- Dependence on stabilized tissue bath perfusion, temperature control (30°C), and calibrated electrical stimulators for consistent results.
- Necessitates cross-team standardization of dissection protocols and stimulation parameters to ensure reproducibility across laboratories.
- Adaptation to different muscle-nerve pairs (e.g., diaphragm-phrenic) may require adjustments in electrode placement and stimulation thresholds.
- Limited to assessing functional NMJ integrity; does not resolve molecular or structural mechanisms underlying observed deficits.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
0:14
Introduction
0:40
Ex Vivo Experimental System
2:57
Dissection of Soleus Muscle and Nerve
4:04
Mounting the Soleus in the Apparatus
5:27
Testing Protocol and Data Collection
5:47
Twitch
6:09
Force Frequency Measurement
6:27
Fatigue Paradigm
7:04
Neurotransmission Functionality Specific Parameters
7:56
Results
9:40
Conclusion
