使用免疫荧光法定量小鼠脑内突触前蛋白的分布

取一块经化学固定的、包埋于组织包埋介质中的小鼠脑切片。

用缓冲液洗涤切片以去除培养基。

加入一种可透化膜并阻断非特异性结合位点的溶液。

移除溶液。

为了观察神经元突触蛋白，将脑片与一抗孵育。

这些抗体靶向特定脑区突触中表达的突触前蛋白，以及一种普遍表达的突触蛋白作为参考标记物。

用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。

加入针对一抗的荧光标记二抗。

用缓冲液洗涤以去除未结合的二抗。

使用DNA结合染料对细胞核进行复染。

用缓冲液清洗切片，并使用适当的封片介质封片。

在共聚焦显微镜下观察切片。

通过计算目标蛋白与参考标记物的平均荧光强度比值，分析目标蛋白在不同脑区中的分布情况。

为进行免疫染色前的切片准备，使用塑料移液管从一个孔中移除PB溶液，注意不要吸入脑切片。然后，使用1,000微升移液器加入250微升新鲜PB溶液，以洗去多余的OCT包埋剂。每次对一个孔进行此洗涤操作，避免切片干燥。

然后，使用塑料移液管从第一孔中移除 PB 溶液。使用 1,000 微升移液器，每孔加入 250 微升封闭缓冲液，逐孔操作。将酶标板在室温下置于摇床上孵育 3 小时。孵育期间，向反应管中每孔加入 250 微升抗体缓冲液。

然后，使用 2 微升移液器加入适量抗体，直接将抗体加入溶液中，并轻轻吹打数次以混匀。随后，涡旋振荡此稀释后的抗体溶液，确保充分混匀。

逐孔操作，用塑料移液管吸除封闭缓冲液，每孔加入250微升一抗溶液。将酶标板置于摇床，4摄氏度孵育过夜。

次日，用塑料移液管移除抗体溶液。在室温下，将切片在摇床上用洗涤缓冲液1洗涤，每孔加入300 µL，每次洗涤10分钟，共洗涤三次。在洗涤过程中，于避光条件下，按照与一抗相同的方法，在反应管中稀释荧光素偶联的二抗。

洗涤完成后，用塑料移液管吸除洗涤缓冲液，每孔加入250微升二抗溶液。室温避光孵育90分钟。孵育完成后，用塑料移液管吸除抗体溶液。用洗涤缓冲液2按照与洗涤缓冲液1相同的方法洗涤切片三次。

在此洗涤过程中，将 DAPI 染色液用 0.1 摩尔 PBS 稀释至 1:2000 的浓度。从孔板中移除洗涤缓冲液后，加入 250 微升 DAPI 溶液，在摇床中室温孵育 5 分钟。

用塑料移液管吸除DAPI溶液后，使用1,000微升移液器向每个孔中加入500微升0.1摩尔的磷酸缓冲液。将显微镜载玻片置于体视显微镜下。用细毛刷在载玻片上分别添加三滴0.1摩尔的磷酸缓冲液。用毛刷将每个切片分别放入一滴缓冲液中，然后压平并调整切片的方向。

所有切片正确放置后，用纸巾去除多余的磷酸缓冲液，并小心地进行干燥，注意不要将切片完全干燥。然后，向载玻片上加入 80 µL 封片介质，并轻轻盖上盖玻片以封固脑切片。

用盖子遮住载玻片以避免光照，并在通风橱中干燥 1 至 2 小时，然后将载玻片置于显微镜载片盒中，在 4 摄氏度下保存，直至进行共聚焦显微镜观察。

按照论文中所述方法获取不同通道的全脑切片虚拟组织图像后，通过点击文件，然后点击打开，将某一图像的所有单通道文件载入Fiji。接着，使用自由手绘选择工具在DAPI通道中勾勒出一个半脑区域。点击编辑，然后选择选择，再创建掩膜以生成所选区域的掩膜图像。

然后点击 分析， 然后 测量 颗粒 为单个通道确定平均荧光强度时，需选择不同的通道，以分别测定各通道的平均荧光强度值。

然后，将各单通道的平均荧光强度复制到电子表格中。为确定感兴趣区域中各单通道的平均荧光 intensity，使用手绘选择工具勾画该区域。