使用免疫荧光定量小鼠大脑中突触前蛋白的分布

取一个化学固定的小鼠脑切片，嵌入组织包埋培养基中。

用缓冲液洗涤切片以除去培养基。

添加一种溶液，使膜透化并阻断非特异性结合位点。

取出溶液。

为了可视化神经元突触蛋白，请将切片与一抗一起孵育。

这些抗体靶向在特定大脑区域的突触中表达的突触前蛋白和普遍表达的突触蛋白作为参考标记。

用缓冲液洗涤以去除未结合的抗体。

引入靶向一抗的荧光团标记的二抗。

用缓冲液洗涤以去除未结合的二抗。

用DNA结合染料复染细胞核。

用缓冲液洗涤并使用合适的封片介质封片

在共聚焦显微镜下观察切片。

计算靶蛋白和参考标记物的平均荧光强度比，以分析靶蛋白在不同大脑区域的分布。

要准备用于免疫染色的切片，请使用塑料移液器从一个孔中取出PB溶液，而无需吸入脑切片。然后，使用 1,000 微升移液器加入 250 微升新鲜 PB 以洗涤多余的 OCT。同时对每个孔重复此洗涤，以避免切片变干。

然后，使用塑料移液器从第一个孔中取出 PB 溶液。使用 1,000 微升移液器每孔添加 250 微升封闭缓冲液，再次良好工作。将板在室温下在摇床上孵育三个小时。在每孔 250 微升抗体缓冲液孵育到反应管中期间。

然后，用2微升移液器加入适量的抗体，直接移液到溶液中，轻轻上下移液数次混合。然后，涡旋这种稀释的抗体以确保正确混合。

孔工作，用塑料移液器去除封闭缓冲液，每孔加入 250 微升一抗溶液。将板在 4 摄氏度的摇床上孵育过夜。

第二天，用塑料移液器取出抗体溶液。每孔用 300 微升洗涤缓冲液 1 洗涤切片，在室温下在摇床上洗涤 3 次，每次 10 分钟。在洗涤过程中，在黑暗中工作，在反应管中稀释荧光团偶联二抗，其方式与之前使用一抗的方式相同。

洗涤完成后，用塑料移液器去除洗涤缓冲液，每孔加入250微升二抗溶液。在室温下在黑暗中孵育90分钟。孵育完成后，用塑料移液器取出抗体溶液。用洗涤缓冲液 2 洗涤切片 3 次，其方法与洗涤缓冲液 1 相同。

洗涤过程中，将DAPI染色剂稀释在0.1摩尔PB中，以达到1至2000的浓度。从板中取出洗涤缓冲液后，加入 250 微升 DAPI 溶液，并在室温下在摇床上孵育 5 分钟。

用塑料移液器去除DAPI溶液后，使用1,000微升移液器每孔添加500微升0.1摩尔PB。将显微镜载玻片放在立体镜下。使用细刷将三滴 0.1 摩尔 PB 滴到载玻片上。使用刷子，在幻灯片上每滴放置一片，然后压平切片并定向。

正确放置所有切片后，使用纸巾去除多余的 PB 并小心干燥，不要完全干燥切片。然后，将 80 微升包埋培养基添加到载玻片上，并小心地用盖玻片覆盖以嵌入脑切片。

盖上载玻片以避免光线照射，并将它们在通风橱中干燥一到两个小时，然后将它们储存在4摄氏度的显微镜载玻片盒中，直到准备好进行共聚焦显微镜检查。

手稿中的描述获取不同通道的全脑切片的虚拟组织后，通过单击"文件"，然后单击"打开"将一张图像的所有单个通道加载到斐济中。然后，使用手绘选择工具在 DAPI 通道中描绘一个半球。单击"编辑"，然后单击"选择"，然后单击"创建蒙版"以创建所选区域的蒙版。

然后单击"分析"，然后单击"测量粒子"以确定单个通道的平均荧光强度，确保选择不同的通道以确定每个通道的平均荧光强度值。

之后，将单个通道的平均荧光强度复制到电子表格中。要确定感兴趣区域中单个通道的平均荧光强度，请使用手绘选择工具划定该区域。