转基因果蝇大脑中蛋白质聚集体的成像和定量

转基因果蝇大脑开始。这些大脑在神经元中表达一种红色荧光标记的突变蛋白，该蛋白可以扩散到周围的神经胶质细胞，表达黄色荧光标记的正常蛋白，引起它们的聚集。

添加保持细胞完整性的固定溶液。

取出固定剂并用缓冲液洗涤。

加入抗褪色试剂并孵育以防止荧光信号褪色。

大脑转移到载玻片上并去除多余的液体。

让大脑粘附在载玻片上。

使用小块盖玻片作为垫片，在上面放一个盖玻片。加入抗淬灭试剂并密封。

在共聚焦显微镜下，使用不同的激发波长捕获红色和黄色荧光的图像。

使用图像分析软件，量化蛋白质聚集体。

红色和黄色荧光的共定位表明突变蛋白的扩散。

所有大脑后，将收集管转移到室温下的章动器上并摇晃约 5 分钟。固定期结束后，使用 P1000 移液器取出大部分固定溶液并将其丢弃，非常小心地将大脑留在管中。这需要轻柔的吸力和仔细观察。

接下来，向大脑中加入 1 毫升新鲜 PBST。盖上管子，让它在章动器上摇晃约一分钟，以洗掉剩余的固定剂。然后，取出溶液并重复这个简短的洗涤步骤。

两次短洗之后，一次 5 分钟的洗涤，然后是三次 20 分钟的洗涤，最后是一次 1 小时的洗涤。最后一次洗涤后，小心地去除大部分PBST，并将大脑浸入30微升甘油基抗褪色试剂中。然后，将大脑在黑暗中在4摄氏度下孵育1至24小时，不动。

然后，使用钝移液器吸头从收集管中取出大脑，并将它们转移到显微镜载玻片上。然后，根据需要轻轻定位大脑，以便使用镊子进行成像。多个样品可以单独的行安装在同一载玻片上。

接下来，使用折叠的实验室组织的一角从载玻片上去除多余的抗褪色试剂。不要让组织与大脑接触。然后，将样品置于黑暗中 5 至 10 分钟，让大脑粘附在载玻片上。

接下来，取小块破碎的盖板玻璃，将它们放在大脑周围，覆盖约 19 平方毫米的区域。然后，将 22 平方毫米的盖板玻璃轻轻放在大脑和玻璃的马赛克上，以制作桥梁支架。接下来，在盖玻片下慢慢分配新鲜的防褪色试剂，使其填充空白区域。非常小心地执行此作，以便大脑和玻璃保持在原位。然后，用指甲油密封盖玻片。首先，只需将其涂抹在角落即可。让角点干燥 5 到 10 分钟，然后沿边缘完成密封。应尽快对大脑进行成像。

使用配备 40 倍或 63 倍油物镜的共聚焦显微镜对安装的大脑进行成像，以收集大脑中表达转基因的区域的 z 切片。然后，通过量化各个 z 切片中的点来分析数据，或者在三维渲染切片之后

要量化分离良好且背景信号很少的突变亨廷顿聚集体，请在 3D 查看模式下打开共聚焦 z 系列。然后，使用分析向导识别所选通道中的各个点。

在设置中，调整阈值和滤波器，以准确地将所有异构大小的聚合表示为图像中的单个对象。然后，在二进制处理预过滤器下启用拆分对象以分离紧密关联的聚合。有关软件识别的对象的定量信息在测量下报告。

计算点数后，在图像分析软件中进一步表征它们。例如，对光斑或表面进行相关测量，以获得骨料直径、体积或强度信息。一些野生型亨廷顿聚集体可以通过手动移动 z 堆栈并计算与周围漫反射信号可区分的绿色点来量化。

单个聚合出现在多个切片中时，请注意避免对它们进行两次计数。另一个有趣的分析是确定亨廷顿 Q25-YFP 和亨廷顿 Q91-mCherry 聚集体之间的共定位频率。通过在共聚焦 z 堆栈中逐个切片移动，使用手动计数来完成此作。