测量大鼠大脑不同亚细胞区室中的蛋白酶体活性

从从对照和恐惧条件大鼠大脑外侧杏仁核收集的亚细胞核和突触部分开始。

每个亚细胞组分都含有不同浓度的 20S 蛋白酶体，蛋白酶体复合物是蛋白酶体复合物的催化核心，负责降解不需要的细胞蛋白。

样品中加入含有ATP和荧光肽底物的测定缓冲液并孵育。

在ATP存在下，蛋白酶体裂解荧光肽，释放游离荧光分子。

使用酶标仪，定期测量荧光强度。

通过将荧光与荧光分子的已知标准浓度进行比较来量化

荧光强度与样品中的蛋白酶体活性成正比。

恐惧条件大鼠核部分蛋白酶体活性增加表明记忆相关基因表达发生变化，而突触部分活性降低表明长期记忆维持所必需的突触蛋白表达发生变化。

要设置测定，请将酶标仪预热至 37 摄氏度并保持整个运行。将"激发"设置为 360 纳米，将"发射"设置为 460 纳米。如果使用的 96 孔板是透明的，请将光学位置设置为底部。如果使用深色 96 孔板，请将光学位置设置为顶部。以 2 小时的时间编程动力运行，每 30 分钟扫描一次。

用 13.5 毫升超纯水复溶试剂盒中提供的 20s 10x 测定缓冲液。将 14 微升 100 毫摩尔 ATP 加入现在的 1x 缓冲液中。这显着增强了样品中的蛋白酶体活性并提高了测定可靠性。用 100 微升 DMSO 重新配制套件中提供的 AMC 标准品。在黑暗或弱光条件下使用 AMC 标准执行步骤，因为该标准对光敏感。

从一系列从高到低的 AMC 浓度创建 AMC 的标准曲线。该曲线将用于酶标仪校准和分析均质样品中蛋白酶体活性。用 65 微升 DMSO 复溶试剂盒中提供的蛋白酶体底物。此外，在黑暗或弱光条件下执行此步骤，因为基材对光敏感。

然后，使用20 S测定缓冲液在新的1.5毫升微量离心管中使蛋白酶体底物稀释1至20。将归一化量的所需样品添加到 96 孔板中。一式两份运行每个样本。所需样品量因组织制备而异。一般来说，10 至 20 微克对于任何亚细胞部分就足够了。

超纯水将样品孔体积提高到 80 微升。添加量取决于添加的样品量。在两个单独的孔中，单独添加 80 微升水。这些将是化试空白。向每个孔中加入 10 微升 20 S 测定缓冲液，包括测定空白。使用中继器或自动移液器确保孔中的测定体积一致。

关灯或进入黑暗的房间。将所有 100 微升稀释的 AMC 标准品添加到新孔中，每个标准品使用一个孔。在黑暗中，使用重复器或自动移液器将 10 微升稀释的蛋白酶体底物添加到含有样品和测定空白的孔中，但不要使用 AMC 标准品。将板放入酶标仪中并开始动力学运行。