测定法错误折叠的蛋白质在细胞中的降解

本报告描述了通过 western blot 或基于荧光的测定法测量错误折叠蛋白质降解率的方案。这些方法可应用于其他错误折叠蛋白质的分析和高通量筛选。

该测定的总体目标是测量错误折叠蛋白质的细胞降解率。错误折叠的蛋白质与许多神经退行性疾病有关。该测定有助于研究细胞蛋白质质量控制系统，这些系统是异常蛋白质的保护剂。

易错折叠的蛋白质可能以不同的形式存在于细胞中。通过将细胞分级分离与环己烷法追踪相结合，该技术的主要优点是专门测量错误折叠物质的半衰期。我们以两种模型蛋白为例。

一种高度易聚集的聚谷氨酸蛋白 Atxn1 82Q 和构象不稳定的核荧光素酶突变体。该方案也可应用于其他错误折叠的蛋白质测量。为了对 Atxn1 82Q GFP 进行降解测定，用 DMEM 培养基和 10% FBS 在 35 毫米板中接种大约 3x10^5 个 HeLa 细胞。

将细胞孵育过夜，使它们在转染时达到 40% 至 60% 的汇合度。用 Atxn1 82Q GFP PRK5 转染细胞后 4 至 5 小时，在荧光显微镜下，使用 450 至 490 纳米的激发波长检查活细胞在细胞核中的 GFP 表达，其特征是存在 GFP 信号的弥散和小斑点。在放线菌酮处理之前，通过去除培养基并使用 3 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞两次来收获一板细胞。

然后将板子在干冰上快速冷冻。对于剩余的细胞板，通过真空抽吸去除培养基，并加入 2 毫升新鲜 DMEM，每毫升放线菌酮含 50 μg。还将 10 微摩尔的蛋白酶体抑制剂 MG132 添加到一个板中。

干冰上冷冻之前，将处理过的细胞孵育 4 小时、8 小时、12 小时和 16 小时。在 16 小时收获 MG132 处理的细胞后，将所有板中的冷冻细胞刮入 150 微升冰冷的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育 30 分钟。在台式离心机中以 17， 000 x g 和 4 摄氏度离心裂解物 15 分钟。

然后将含有 MP40 可溶性蛋白的上清液转移到另一个试管中。通过向试管中轻轻添加约 200 微升 1x PBS 来冲洗沉淀，而不会干扰沉淀。通过抽吸或移液管小心去除 PBS，将沉淀重悬于 150 μL 冰冷沉淀缓冲液中，然后在冰上孵育 15 至 30 分钟。

接下来，将 75 微升 3x 沸腾缓冲液加入 MP40 可溶性级分和从沉淀中重悬的 MP40 不溶性级分中。然后在加热块上将样品在 95 摄氏度下加热 5 分钟。将 SDS 凝胶上样缓冲液加入煮沸的 MP40 可溶性和不溶性级分的等分试样中。

将从所有时间点收集的等体积样品上样到 SDS-PAGE 凝胶上。使用抗 GFP 抗体和增强的化学发光，通过蛋白质印迹检测 MP40 可溶性和 SDS 可溶性 Atxn1 82Q GFP。为了用过滤延迟测定法检查来自沉淀级分的 SDS 抗性 Atxn1 82Q，设置一个装有 0.2 微米醋酸纤维素膜的点图装置。

然后将 80 至 120 微升煮沸的 MP40 不溶性样品加载到斑点印迹仪的每个孔中。通过真空过滤膜中的样品后，通过抗 GFP 免疫印迹检测粘附在膜上的 Atxn1 82Q GFP 聚集体。使用过滤延迟测定来检查 SDS 抗性形式随时间变化的水平至关重要。

这是因为 SDS 可溶性形式可能会转化为 SDS 抗性形式，而不是被降解。在这个例子中，SDS 抗性形式是最小的，并且在追踪实验中保持相似的水平。为了进行降解测定，在用 NLS-荧光素酶-GFP 转染 HeLa 细胞过夜后，在倒置荧光显微镜下用 450 至 490 纳米的激发波长检查活细胞的 GFP 表达。

在放线菌酮处理之前，通过去除培养基收获一板细胞，并使用 3 毫升冰冷的 PBS 洗涤细胞两次。然后将板子在干冰上快速冷冻。对于剩余的板，去除培养基后，加入 2 毫升新鲜 DMEM，每毫升放线菌酮含 50 微克，并向一个板中加入 10 微摩尔蛋白酶体抑制剂 MG132。

如前所述，在收获前将细胞处理 1.5、3、4.5 和 6 小时，在 6 小时收获 MG132 处理的细胞。收获细胞的最后一个时间点后，将每个板刮入 150 微升冰冷的细胞裂解缓冲液中，并在冰上孵育 30 分钟。将样品在 95 摄氏度的加热块上孵育 5 分钟，然后根据文本方案进行 SDS-PAGE 和 Western 印迹。

向全细胞裂解物中加入 SDS 凝胶上样缓冲液，终浓度为 2% SDS 和 50 毫摩尔 DTT。根据文本方案在 96 孔板中接种和转染 HeLa 细胞后，转染后 20 至 24 小时，检查细胞的 GFP 表达。去除培养基，向每个孔中加入大约 200 微升 1x PBS，然后吸出以去除残留的 DMEM。

向一组样品中加入 60 微升含 5% FBS 的低荧光 DMEM 和 50 微克/毫升放线菌酮，并将 10 微摩尔 MG132 添加到一组样品中。使用荧光读板机测量 GFP 信号，每小时读取一次板，持续长达 8 至 10 小时。导出数据并根据文本协议进行统计分析。

在稳态分析中，转染后 20 小时，可以在 30% 至 50% 的 HeLa 细胞中观察到显微镜下可见的 Atxn1 82Q GFP 核聚集体。从蛋白质印迹法中可以看出，SDS 可溶性组分中 Atxn1 82Q GFP 的半衰期约为 5 小时。与 MP40 可溶性组分中 Atxn1 82Q GFP 在 16 小时内略有降低或无降低相反。

用 MG132 处理细胞部分抑制了 Atxn1 82Q GFP 的降解。这些图像表明，转染后 20 小时，NLS-荧光素酶 DM 突变体 GFP 聚集体在 5% 至 15% 的 HeLa 细胞中变得显微可见。蛋白质印迹显示，SDS 可溶性 NLS-荧光素酶 DM 突变体 GFP 的半衰期为 2 至 3 小时。

此外，在放线菌酮处理后，转染细胞的荧光强度也随着时间的推移而降低。在放线菌酮处理后约 6 小时，可溶性 NLS-荧光素酶 DM 突变体 GFP 在很大程度上降解，表明剩余的荧光是由抗降解的聚集物种产生的。这些荧光图像证实，在放线菌酮处理 9 小时后，聚集但未弥散的 GFP 仍留在细胞中。

嗯，基于免疫印迹的测定需要几天才能完成。使用基于荧光的测定法，可以在放线菌酮追踪后立即获得蛋白质降解速率。免疫印迹和基于荧光的分析均可应用于其他错误折叠蛋白质的研究。

后者也适用于高通量筛选，用于鉴定可以调节错误折叠蛋白质降解的大分子或小化合物。重要的是要记住，对于一些错误折叠的蛋白质，如 Atxn1 82Q，半衰期只能通过细胞分级和免疫印迹来测量，这是因为快速降解的错误折叠物质仅占 Atxn1 82Q 总表达的一小部分。为了揭示蛋白质质量控制的机制，蛋白质降解测定需要与聚集体的稳态水平分析以及它们是不同细胞组分的分区相结合。

还可以进行其他实验，如体外蛋白质折叠和聚集测定。观看此视频后，您应该对如何使用不同策略测量错误折叠蛋白的降解率有很好的了解。感谢您的观看，祝您的实验好运。