使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

本文介绍了一种结合免疫荧光、共聚焦显微镜和计算机分析的方法，用于确定突触蛋白相对于参考蛋白的分布情况。该方法通过采用荧光强度比值而非绝对荧光水平，避免了免疫荧光染色固有的变异性。此外，利用该方法还可分析蛋白质分布在不同层面的异质性。

从全脑切片到脑区，乃至海马体的不同层次等亚区。该技术可经调整后用于确定蛋白质在除脑组织以外的其他组织以及除小鼠以外的其他模式系统中的分布。首先按照文中的描述，对先前分离并固定的鼠脑进行洗涤。

然后将脑组织转移至含有30%蔗糖（0.1摩尔磷酸盐缓冲液）的15毫升反应管中。为进行冷冻保护，将脑组织在4摄氏度下孵育48小时，或直至其完全沉底。随后，使用锋利刀片根据目标区域修整已进行冷冻保护的脑组织。接着将脑组织放入冷冻模具中，并加入最佳切割温度化合物（OCT）进行包埋，注意避免产生气泡，并正确调整脑组织的方向，以确保能够进行冠状面切片。

将冷冻模具置于负80摄氏度的冰箱中，直至完全冻结。将冻结的组织固定在冷冻切片机上，并等待至少15分钟，使其温度与切片机环境平衡后再进行切片。开始切割脑组织，制备厚度为25 µm的冠状切片。

使用玻璃钩小心钩取第一片切片的OCT包埋剂，避免接触脑组织。OCT包埋剂会黏附在玻璃钩上。用玻璃钩将脑切片转移至第一孔中。

在24孔板中每孔收集三个相邻的切片，孔内预先加入0.1摩尔的磷酸缓冲液（PB）。将切片置于4摄氏度保存，最多可保存两周。为进行免疫染色，使用塑料移液管从一个孔中吸除PB溶液，注意不要吸入脑切片。然后使用1000微升移液器加入250微升新鲜PB，以洗去多余的OCT包埋剂。

每次仅处理一个孔，重复此洗涤步骤，以避免切片干燥。然后，使用塑料移液管从第一孔中移除磷酸缓冲液。再使用1000微升移液器，每孔加入250微升封闭缓冲液，逐孔操作。

将培养板置于摇床上，室温孵育三小时。孵育期间，向反应管中每孔加入250微升抗体缓冲液。然后使用2微升移液器将适量抗体直接加入溶液中，并轻轻吹打混匀数次。

然后涡旋混匀该稀释后的抗体，以确保充分混匀。逐孔用塑料移液管吸除封闭缓冲液，并每孔加入250 µL一抗溶液。将板置于4°C摇床上过夜孵育。

次日，用塑料移液管移除抗体溶液。在室温下，用 300 µL 洗涤缓冲液对每个孔中的切片在摇床上洗涤三次，每次 10 分钟。在洗涤过程中，于避光条件下，像之前处理一抗一样，在反应管中将荧光二抗稀释。

洗涤完成后，用塑料移液管吸出洗涤缓冲液，每孔加入250微升二抗溶液。室温避光孵育90分钟。孵育完成后，用塑料移液管吸出抗体溶液。

以与使用洗涤缓冲液一相同的方式，用洗涤缓冲液二清洗切片三次。在洗涤过程中，将DAPI染色剂用0.1摩尔的PB稀释至1:2000的浓度。从孔板中移除洗涤缓冲液后，加入250微升DAPI溶液，在摇床上室温孵育5分钟。

用塑料移液管吸除 DAPI 溶液后，使用 1000 微升移液器向每孔加入 500 微升 0.1 摩尔的磷酸缓冲液。将显微镜载玻片置于体视显微镜下，用细毛刷在载玻片上分别添加三滴 0.1 摩尔的磷酸缓冲液。

用毛笔将每滴液滴上放置一片切片，然后压平并调整切片方向。待所有切片正确放置后，用纸巾吸除多余的磷酸缓冲液，并小心干燥，注意切片不可完全干透。随后，向载玻片上加入 80 微升封片介质，再小心地盖上盖玻片，以封固脑切片。

用盖玻片覆盖，避免光照，并在通风橱中干燥一到两小时，然后将切片置于显微镜载玻片盒中，在 4 摄氏度下保存，直至进行共聚焦显微镜观察。按照文中所述获取全脑切片不同通道的虚拟组织图像后，通过点击“文件”然后选择“打开”，将所有单通道图像或单张图像载入 FIJI。随后在 DAPI 通道中使用自由手绘选择工具勾勒出一个半脑区域。

单击编辑，然后选择，再创建蒙版，以对选定区域创建蒙版。接着单击分析，然后测量颗粒，以确定单个通道的平均荧光强度。确保选择单个通道，以获取每个通道的平均荧光强度值。

随后，将各单通道的平均荧光强度复制到电子表格中。为确定感兴趣区域中各单通道的平均荧光 intensity，需使用手绘选择工具勾画该区域。使用DAPI染色后，细胞核呈阳性，脑切片呈现点状模式，细胞密度高的区域比细胞密度低的区域更亮。

使用Mover抗体染色显示脑内分布呈异质性，存在明亮的热点区域和较暗的区域，而突触素（Synaptophysin）则呈现较为均一的分布。图像叠加显示，指示Mover蛋白的红色荧光与指示突触素的绿色荧光分布存在差异。经定量分析后，已确定Mover和突触素在不同半脑及感兴趣区域中各通道的平均荧光强度值。

通过计算Mover荧光值与突触素（Synaptophysin）荧光值的比值，可显示Mover在突触小泡周围分布的异质性，表现为某些区域Mover水平较高，而另一些区域则较低。相对Mover丰度是指某一特定区域的比值与整个半脑平均比值相比，并转换为百分比形式，用以反映该特定区域中Mover相对于平均水平的含量。在海马体不同亚区的各层中均测定了相对Mover丰度。

通过比较各层中感兴趣区域的比值与相应半脑的比值，对三个感兴趣区域进行定量分析。该方法可轻松适应并与其他成像技术（如超分辨率显微镜）结合，以进一步确定目标蛋白的亚细胞分布。该技术也可应用于不同的模型系统，例如基因修饰动物或药物处理动物。

这可以实现不同实验条件甚至不同物种之间的比较研究。