Name: 定量自动放射法测定维沃脑蛋白合成区域速率 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学习定量放射自显影技术测定脑内蛋白质合成区域速率的方法，该技术使用L-[1-14C]-亮氨酸示踪剂在清醒活动动物中进行全定量测量，可同时检测多个脑区的神经可塑性变化。

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作者谨此感谢夏增艳在小鼠基因分型方面的工作，感谢汤姆·伯林在氨基酸和胶片处理方面的工作，以及感谢秦梅在部分rCPS实验中的贡献。本研究由美国国家精神卫生研究院（NIMH）院内研究计划（ZIA MH00889）资助。RMS还获得了自闭症之声基金会博士后奖学金（8679）和FRAXA博士后奖学金的支持。

注意：所有动物实验程序均经国家精神卫生研究所动物护理和使用委员会批准，并遵循美国国立卫生研究院关于动物护理和使用指南的规定执行。
方案的概述见图1。
1. 通过手术在股静脉和股动脉中植入导管，分别用于示踪剂的给药和定时采集动脉血样。手术应在示踪剂给药前至少22小时完成。手术过程约需1小时。
<ol>
	<li>准备所需材料：无菌外科器械（手术剪、显微剪、镊子、三把外科皮肤拉钩）、异氟烷麻醉设备（异氟烷挥发器、主动式废气清除装置、密闭麻醉室、麻醉面罩）、无菌手术台、毛发剪刀、70%乙醇、聚维酮碘、无菌纱布、外科胶带、商用暖手袋、手术显微镜、无菌0.9%氯化钠溶液（生理盐水）、含肝素100 USP单位/毫升的无菌0.9%氯化钠溶液（肝素化生理盐水）、五段无菌20厘米长6-0可吸收缝线、无菌25厘米长PE-8和PE-10聚乙烯导管各一段，其中一端切成45°斜面o，无菌1 cc注射器、无菌32号针头、电灼设备、无菌15-20 cm中空不锈钢棒（内径2.5 mm，外径3 mm）、局部麻醉药（布比卡因和利多卡因软膏）、带旋转连接装置的动物饲养笼（30 cm弹簧束缚线，带按钮、旋转接头、旋转支架和支架臂，20 × 13 cm透明圆柱形容器）。</li>
	<li>准备动物以进行手术。</li>
	<li>确保根据贵机构的要求，采用适当的无菌和无菌技术。
	<ol>
		<li>称重动物。动物体重必须至少达到25 g，才能进行成功的手术。</li>
		<li>将动物放入一个密封的聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）腔室中，并将该腔室连接至异氟烷麻醉装置。设定氧气中异氟烷浓度为1.5%，雄性动物的气体流速设为2.5 L/min，雌性为3.0 L/min2约2分钟后，通过捏脚趾观察是否无回缩反射来确认小鼠是否已适当麻醉。</li>
		<li>麻醉后，将小鼠从麻醉舱中取出，俯卧放置，使其面部位于麻醉鼻罩内。将鼻罩连接至挥发器以接收麻醉气体，并连接废气收集装置以回收气体。废气收集装置将通过活性炭过滤器捕获异氟烷。</li>
		<li>使用剪毛器剃除肩胛骨之间的毛发。确保对剃毛区域进行充分消毒，交替使用碘伏和乙醇擦拭三次。</li>
		<li>将小鼠翻转至仰卧位，保持其面部位于鼻罩中。用胶带将小鼠左腿固定于手术台上，使用电动剃毛器剃除左侧大腿内侧至左上腹部区域的毛发。确保对剃毛区域进行充分消毒，交替使用聚维酮碘和乙醇擦拭三次。</li>
		<li>将一个已激活的市售暖手袋用纱布包裹后，滑入小鼠身下。用胶带将小鼠右腿固定在手术台上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将导管插入左侧股静脉。
	<ol>
		<li>在手术显微镜辅助下，使用手术剪从左侧大腿上内侧部位向头侧至中线方向做1 cm切口，暴露股动脉和股静脉。</li>
		<li>用外科皮肤拉钩牵拉松弛的皮肤，以进一步暴露水疱。</li>
		<li>用无菌的0.9%氯化钠溶液处理暴露区域，以保持适当的湿润度。</li>
		<li>使用镊子进行钝性解剖，分离股动脉和静脉周围的一小段结缔组织。仔细分离动脉与静脉（图2).</li>
		<li>使用镊子将一根可吸收缝线（A股）从切口最外侧处穿过股静脉和股动脉的下方。将缝线拉至一半，使两端长度相等。</li>
		<li>在靠近腹股沟更近端的位置，使用镊子将第二根缝线（B线）仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个半结，用于限制血流。</li>
		<li>在股静脉下方的A线与B线之间的某一点，用镊子将第三根缝线（C线）仅从股静脉下方穿过。轻柔地打一个完整的结，用于限制血流，注意不要撕裂静脉。</li>
		<li>轻轻拉动B端以限制血流。使用止血钳轻轻牵拉B端，以维持受限的血流状态。</li>
		<li>用显微剪刀在股静脉受限区域剪开一个小孔，将预先用肝素化生理盐水冲洗过的PE-8导管的斜端小心地插入，朝向B线。插入后，松开B线的张力，继续将导管沿静脉向上推进。随后在包含导管的静脉周围收紧B线。</li>
		<li>使用C股线在导管周围再打一个结。确保此结不包含股动脉。</li>
		<li>轻轻回抽注射器筒芯，使血液部分充满导管，以确认导管已正确植入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用相同操作步骤，将PE-10导管插入左侧股动脉。</li>
	<li>完整的手术过程
	<ol>
		<li>在股静脉和股动脉导管均固定后，将A线在两根导管周围打结。</li>
		<li>剪除所有多余的缝线并取下皮肤拉钩。用肝素化生理盐水冲洗动脉导管，以防凝血。灼烧两根导管的末端以形成密封。</li>
		<li>将小鼠置于俯卧位，在颈部基部做一小切口，并向暴露区域滴加生理盐水。</li>
		<li>从颈部切口到股部切口皮下插入中空金属杆。将导管穿过中空金属杆并从颈部切口引出。移除中空金属杆。皮下植入导管可防止小鼠损伤导管。</li>
		<li>将布比卡因涂抹于伤口两侧。用缝线闭合股部切口。在闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。</li>
		<li>将导管穿过一根30 cm长的柔性中空管（弹簧 tether），并将弹簧tether的按钮缝合于皮下。将布比卡因涂抹于伤口两侧。将弹簧tether的按钮缝合于皮下。在闭合的缝合伤口上涂抹利多卡因软膏。</li>
		<li>将小鼠移入一个透明的圆柱形容器（高20 cm，直径13 cm）中，容器配有旋转支架和支撑臂，用于动物在恢复期间的安置。在容器下方放置一个暖手袋，以保持动物体温。</li>
		<li>将弹簧 tether 的顶端拧到转环上，并将转环固定到连接在圆柱形容器上的转臂上。确保小鼠能够自由活动，并且可以接触导管。</li>
		<li>在动物饲养箱上放置一个带孔的盖子，确保其不会妨碍旋转装置的运作。参考 图3 完整的设置。</li>
		<li>让小鼠恢复，建议至少恢复22小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 准备用于注射的 L-[1-14C]亮氨酸溶液以及用于沉淀血浆样品蛋白的 16% (w/v) 5-磺基水杨酸（SSA）二水合物溶液。在 SSA 溶液中还需加入 0.04 mM 正亮氨酸和每毫升含 1 µCi 的 [H3]亮氨酸，分别作为氨基酸分析及酸溶性血浆组分中示踪剂浓度分析的内标物。SSA 溶液可于 4 °C 保存不超过两个月。
<ol>
	<li>购买市售的 L-[1-14C]亮氨酸（50-60 mCi/mmol），该产品以 2% 乙醇或 0.1 N HCl 溶液形式出售。取已知放射活性的示踪剂，在温和的氮气流下吹干，然后重新溶解于无菌生理盐水中，配制成浓度为 100 μCi/mL 的溶液。</li>
</ol>
3. 静脉注射 L-[1-14C]亮氨酸并采集动脉血样本。
<ol>
	<li>准备所需材料：18 个 1.5 mL 离心管（用于血浆去蛋白处理，每管加入 70 mL 去离子水），17 个 250 mL 玻璃小瓶插件（15 个用于采集动脉血样本，2 个用于收集死腔血以重新注入。为减少额外和不必要的血液采集，建议使用底部锥形、便于移取上清血浆的小型细长玻璃小瓶插件），2 根微毛细管（32 × 0.8 mm，用于 hematocrit 测定），1 根涂有肝素和氟化锂的微型离心管（分别用于防止凝血和糖酵解），止血钳（钳尖用 Tygon 塑料管包裹，以防夹伤 PE 导管），血糖仪，血压换能器，1 mL 无菌注射器（用于生理盐水冲洗），以及市售的安乐死溶液（用去离子水按 1:1 稀释（适用于小鼠））。</li>
	<li>确保实验开始时动物处于正常的生理状态。
	<ol>
		<li>将动脉导管在距末端约 2 cm 处夹住，并剪去管尖，形成血液流出的开口。然后松开夹子，收集死腔血（约 30 µL），以获取之前采样残留的生理盐水和/或血液；另取一个独立离心管，分别采集对照样本（约 30 µL）、红细胞压积样本（约半根毛细管体积）和血糖样本（约 20 µL）。</li>
		<li>用密封胶泥封住毛细管一端，以 4500 × g 离心 1 分钟测定红细胞压积。测量红细胞体积占全血总体积的比例。若动物的红细胞压积低于 30%，则不应继续实验。</li>
		<li>使用市售血糖仪测定一滴血液中的葡萄糖水平。</li>
		<li>将对照样本以 18,000 × g 离心 2 分钟，分离血浆。按如下方法对血浆样本进行去蛋白处理：在 1.5 mL 离心管中加入 5 µL 血浆和 70 µL 去离子水，再加入 25 µL 16% SSA 溶液，涡旋混匀。冰上放置 30 分钟后，置于干冰上冷冻。</li>
		<li>通过静脉通路将死腔血回输给动物，随后用肝素化生理盐水冲洗，以防止过多失血。</li>
		<li>将动脉通路连接至血压换能器，以测量平均动脉血压。</li>
		<li>采样后务必重新夹闭动脉管路，并用少量（50 µL）肝素化生理盐水冲洗管路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉注射示踪剂并采集定时动脉血样本。
	<ol>
		<li>使用 Y 型连接器，将一支装有示踪剂（100 µCi/kg）的注射器和一支装有 50 µL 无菌生理盐水的注射器连接，以便在注射示踪剂后冲洗静脉通路。将 Y 型连接器连接至静脉通路。</li>
		<li>启动实验时，同时开始计时并注射示踪剂。注射后立即用生理盐水（约 100 µL）冲洗静脉通路。</li>
		<li>在实验前 2 分钟内连续采集第 1 至第 7 个血样，方法相同。采集第 7 个样本后，每次采集后续样本前均需先收集 30 µL 死腔血。第 8 至第 14 个样本分别在 3、5、10、15、30、45 和 60 分钟时采集。</li>
		<li>采集后立即处理血样，处理方法同对照样本。若存在延迟，应将样本置于冰上。通过动脉导管小心将死腔血重新注入动脉，并用肝素化生理盐水冲洗。</li>
		<li>在实验过程中某个时间点，制备三个内标样本：向 75 µL 水中加入 25 µL 16% SSA、0.04 mM 正亮氨酸和 1 mCi/mL [3H]亮氨酸，涡旋混匀后置于冰上。</li>
		<li>在 60 分钟采集第 14 个样本后，向静脉通路注入约 0.2 mL B-euthanasia-D 溶液以处死动物。记录死亡时间。</li>
		<li>将动物从旋转接头装置上卸下并移出动物饲养箱。小心取出脑组织，置于铝箔上，并在干冰上速冻。切勿使用液氮冷冻脑组织，以防脑组织开裂。将脑组织、样本及内标物在 -80 ˚C 下保存，直至进行后续处理。后续处理可在任意时间进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 分析血浆样品中亮氨酸和L-[1-14C]亮氨酸的浓度。
<ol>
	<li>将样品和内标物在冰上解冻，涡旋混匀后于2 ˚C以18,000 × g离心5分钟。上清液部分将含有游离的标记与未标记亮氨酸。</li>
	<li>转移 40 µL 将上清液转移至液体闪烁瓶中，并加入闪烁液。定量测定每分钟衰变数（DPM） 3H 和 14通过液体闪烁计数法及专为双标记同时检测设计的淬灭曲线测定 C3H 和 14C）计数。</li>
	<li>使用配备钠阳离子交换柱的高效液相色谱系统，通过柱后邻苯二甲醛衍生化及荧光检测法测定血浆亮氨酸浓度。
	<ol>
		<li>将高效液相色谱仪（HPLC）设置为以下参数：荧光检测器激发波长330 nm，发射波长465 nm。流动相由pH 7.40的钠系洗脱液和含5%四氢噻吩砜（sulfolane）的pH 3.15钠系洗脱液组成。缓冲液流速设为0.400 mL/min，衍生化装置流速设为0.300 mL/min。色谱柱温度设为48 ˚C，反应器温度设为45 ˚C。</li>
		<li>使用30至500 pmol/10mL范围内的氨基酸浓度（包括正亮氨酸）对系统进行校准。校准曲线呈线性。待测10 mL注射样品中的氨基酸浓度均在此校准曲线范围内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 进行定量放射自显影。
<ol>
	<li>为进行自显影，准备厚度为 20 µm 的脑切片。使用冷冻切片机在 -20 ˚C 下对脑组织进行切片。</li>
	<li>将连续的脑切片贴附于明胶包被的载玻片上，自然解冻后风干。</li>
	<li>将载玻片在 10% 福尔马林溶液中换液洗涤五次，每次 30 分钟，随后用去离子水持续冲洗 1 小时。用铝箔 loosely 覆盖载玻片以防止灰尘污染，并静置干燥 24 小时。</li>
	<li>将载玻片与一组 [14C]甲基丙烯酸甲酯标准品一同放入 X 射线胶片暗盒中（推荐使用可容纳 20×25 cm 乳腺摄影胶片的暗盒），标准品需事先根据已知 14C 浓度的组织进行校准，方法如文献29所述。标准品可商业购买，但需确保其覆盖 2–300 mCi/g 组织的浓度范围，并针对 20 µm 组织厚度进行过校准。在红光安全灯下，将一张乳腺摄影胶片乳剂面向下放置于切片上方。</li>
	<li>密封暗盒并置于黑色换片袋中，存放于柜内曝光 40–45 天。</li>
	<li>按照制造商说明显影胶片。注意：不推荐使用自动胶片显影，因为背景可能不均匀，影响定量结果。</li>
</ol>
6. 分析图像。
注意：建议使用一种市售的图像分析软件，并结合 CCD 相机和具有均匀照明的荧光灯箱。CCD 相机可检测照明胶片上的相对光密度。
<ol>
	<li>根据胶片上一组已校准标准品的光密度（OD）构建光密度（OD）与组织14C浓度之间的校准曲线。将这些数据（包括空白或背景值）拟合至多项式方程，二次或三次多项式方程均可获得良好的拟合效果。</li>
	<li>为分析特定脑区，通过与脑图谱比对，在六至八张切片中定位感兴趣区域（ROI）。记录所有切片中ROI内各像素的光密度（OD）值，并依据校准曲线计算每个像素的组织14C浓度，进而计算该ROI内的平均组织14C浓度。</li>
</ol>
7. rCPS 的计算。通过以下公式计算每个 ROI 的 rCPS：
<img alt="公式中的静态平衡方程 \( R_i = \frac{P_i^*}{\lambda_i \int_0^T \left[\frac{C_p^*(t)}{C_p}\right] dt} \)" src="/files/ftp_upload/58503/58503eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程">
其中，P*(T) 表示 ROI 内组织中 14C 的加权平均浓度，Cp(t) 和 C*p(t) 分别表示在时间 t 时动脉血浆中未标记和标记亮氨酸的浓度，T 为动物死亡的时间（约 60 分钟），λ 表示组织前体池中来自血浆的亮氨酸所占的比例。对 λ 的评估需通过单独的实验进行6。λ 已在野生型（WT）、Fmr1 基因敲除型、Tsc+/- 型以及苯丙酮尿症（PKU）小鼠中进行了评估6,22,25,28。如果实验涉及可能影响蛋白质合成、降解或亮氨酸代谢速率的遗传或药理学干预，则应在新的实验条件下重新评估 λ 的值。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

我们介绍一种在实验动物体内定量测定脑区蛋白质合成速率（rCPS）的方法。该方法相较于现有方法具有显著优势：1. 测量在清醒、正常活动的动物中进行，因此能够反映大脑功能状态下正在进行的生理过程。2. 通过定量放射自显影技术进行测量，可同时测定脑内所有区域及亚区域的rCPS。3. 该方法的动力学模型考虑了组织蛋白质降解产生的未标记氨基酸重新进入氨基酸池（即“再循环”）的可能性，及其对蛋白质合成前体池的影响6。
该方法的主要局限性在于其耗时且要求较高。尽管采用更简单、通量更高的方法颇具吸引力，但必须认识到所获得数据的局限性。
由于在完整的小鼠体内测量rCPS具有复杂性，可能会遇到维持正常生理状态、采集足够的血液样本以及避免可能干扰因素等方面的问题。静脉和动脉导管的外科植入具有挑战性。与任何外科手术一样，尤其是处理 delicate vasculature 时，动物死亡存在固有风险。对我们而言，这种情况较为罕见（约1%）。在随后22小时的恢复期间，偶尔（约4%）会有动物将导管拔出。在测量...

蛋白质合成是&#160;神经系统长期适应性变化所必需的重要生物学过程1抑制蛋白质合成会阻断无脊椎动物和脊椎动物的长期记忆存储2蛋白质合成对于维持某些形式的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）的晚期阶段至关重要3发育过程中的神经元存活4以及神经元及其突触连接的常规维持5脑蛋白合成速率的测量可能是研究适应性变化以及神经发育障碍和与学习记忆相关疾病的重要工具。
我们已开发出一种方法，可在清醒动物体内定量测定脑蛋白质合成速率，该方法相较于其他用于估计脑组织离体或体外样本中合成速率的技术具有固有优势6。最主要的优势在于其适用于清醒动物完整脑组织中的测量。这一点至关重要，因为它能够在突触结构与功能保持完整的情况下进行测定，且无需担忧死后效应的影响。此外，我们所采用的定量放射自显影方法具有高度的空间定位能力。尽管14C的能量限制使得我们无法在亚细胞或细胞水平上对示踪剂进行精确定位，但我们仍可在细胞层和如下丘脑核团等较小的脑区中测量合成速率，空间分辨率约为25 µm7。
使用放射性示踪剂进行体内测量的一个挑战在于确保所测得的放射性标记存在于目标反应产物中，而非未反应的标记前体或其他非相关的标记代谢产物中。6我们选择了 L-[1-14C]-亮氨酸作为示踪氨基酸，因为它要么被掺入蛋白质，要么迅速被代谢 14CO2, 在大量未标记的CO中被稀释2 由于大脑能量代谢速率高，导致脑组织中产生8此外，任何 14未掺入蛋白质的C主要以游离形式存在[14C]-亮氨酸，在60分钟的实验期间内，几乎完全从组织中清除6蛋白质随后用甲醛固定于组织上，并用清水冲洗以去除任何游离的[14C]-亮氨酸标记，随后进行放射自显影。
另一个重要的考虑因素是，组织蛋白质分解产生的非标记氨基酸会稀释前体氨基酸池的特异性放射活性。我们已证明，在成年大鼠和小鼠中，脑内蛋白质合成所用的前体亮氨酸池约有40%来源于蛋白质降解产生的氨基酸6。在计算脑区蛋白质合成速率（rCPS）时必须计入这一因素，并且在相关关系可能发生改变的研究中必须对此加以验证。该方法的理论基础和假设已在其他文献中详细阐述6。本文则重点讨论该方法应用中的实验操作问题。
该方法已用于测定地松鼠9、绵羊10、恒河猴11、大鼠12,13,14,15,16,17,18,19,20,21、结节性硬化症小鼠模型22、脆性X综合征小鼠模型23,24,25,26、脆性X前突变小鼠27以及苯丙酮尿症小鼠模型28中的rCPS。在本论文中，我们介绍了使用活体放射自显影L-[1-14C]-亮氨酸法测定rCPS的操作步骤。我们展示了清醒对照小鼠脑区中的rCPS。此外，我们还证明了体内给予翻译抑制剂茴香霉素可完全消除脑内的蛋白质合成。

<table><tbody><tr><td>小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>003024</td><td>&lt;em&gt;Fmr1 &lt;/em&gt;基因敲除繁育对</td></tr><tr><td>茴香霉素</td><td>Tocris 生物科学</td><td>1290</td><td></td></tr><tr><td>微量压积管</td><td>德拉蒙德科学公司</td><td>1-000-3200-H</td><td>毛细管</td></tr><tr><td>Critoseal 毛细管密封剂</td><td>徕卡显微系统公司</td><td>39215003</td><td>密封腻子</td></tr><tr><td>玻璃小瓶内插管</td><td>安捷伦科技公司</td><td>5183-2089</td><td>用于采集血液样本</td></tr><tr><td>Digi-Med 血压分析仪</td><td>Micro-Med 公司</td><td>BPA-400</td><td>血压分析仪</td></tr><tr><td>Bayer Breeze 2 血糖监测系统</td><td>Bayer Breeze</td><td>9570A</td><td>血糖仪</td></tr><tr><td>气密注射器</td><td>哈密尔顿公司</td><td>1710</td><td>结核菌素玻璃注射器</td></tr><tr><td>HeatMax HotHands-2 暖手袋</td><td>HeatMax</td><td>型号 HH2</td><td>加热垫</td></tr><tr><td>肝素锁冲洗液</td><td>Fresenius Kabi USA, LLC</td><td>504505</td><td>肝素生理盐水</td></tr><tr><td>透明动物容器</td><td>Instech</td><td>MTANK/W</td><td>动物饲养笼</td></tr><tr><td>弹簧束缚装置</td><td>Instech</td><td>PS62</td><td>导管管路/啮齿类动物固定装置</td></tr><tr><td>旋转接头</td><td>Instech</td><td>375/25</td><td>连接至弹簧束缚装置</td></tr><tr><td>旋转臂及支架</td><td>Instech</td><td>SMCLA</td><td>连接旋转接头和动物饲养笼</td></tr><tr><td>束缚按钮</td><td>Instech</td><td>VAB62BS/22</td><td>连接至弹簧束缚装置底部</td></tr><tr><td>不锈钢管</td><td>自制</td><td>N/A</td><td>用于将导管穿过小鼠体内</td></tr><tr><td>Matrx VIP 3000</td><td>Matrx</td><td>91305430</td><td>异氟烷蒸发器</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Stoelting 公司</td><td>50207</td><td>异氟烷/氟烷吸附剂</td></tr><tr><td>电动剪毛器</td><td>Oster Finisher</td><td>型号 59</td><td></td></tr><tr><td>外科皮肤拉钩</td><td>自制（??）</td><td>N/A（??）</td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠生理盐水</td><td>APP 制药有限责任公司</td><td>918610</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>精细科学工具公司</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>精细科学工具公司</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>UNIFY 丝制外科缝线</td><td>AD 外科公司</td><td>#S-S618R13</td><td>6-0 USP，不可吸收</td></tr><tr><td>PE-8 聚乙烯管</td><td>SAI 输注技术公司</td><td>PE-8-25</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>贝克顿-迪金森公司</td><td>309659</td><td>1cc/mL</td></tr><tr><td>PE-10 聚乙烯管</td><td>Clay Adams</td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>MCID 分析软件</td><td>Imaging Research 公司</td><td>版本 7.0</td><td>光密度分析</td></tr><tr><td>明胶包被载玻片（75×25 mm）</td><td>FD Neurotechnologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>徕卡</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Super RX-N 医用X光胶片</td><td>富士</td><td>47410-19291</td><td></td></tr><tr><td>Hypercassette（8×10 英寸）</td><td>Amersham Pharmacia Biotech</td><td>11649</td><td></td></tr><tr><td>[1-&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;C]亮氨酸</td><td>Moravek</td><td>MC404E</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sarstedt 股份有限公司 &amp;amp; Co.</td><td>72.692.005</td><td>用于血液样本去蛋白处理</td></tr><tr><td>玻璃巴斯德移液管</td><td>Wheaton</td><td>357335</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>18421</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>美国国立卫生研究院供应中心</td><td>6830009737285</td><td></td></tr><tr><td>闪烁液</td><td>CytoScint</td><td>882453</td><td></td></tr><tr><td>液体闪烁计数器</td><td>Packard Tri-Carb</td><td>2250CA</td><td></td></tr><tr><td>氨基酸分析仪</td><td>Pickering 实验室</td><td>Pinnacle PCX</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 系统</td><td>安捷伦科技公司</td><td>1260 Infinity</td><td>包含 1260 Bio-Inert 泵</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>M650</td><td></td></tr><tr><td>磺基水杨酸</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>MKBS1634V</td><td>5-磺基水杨酸二水合物</td></tr><tr><td>正亮氨酸</td><td>西格玛公司</td><td>N8513</td><td></td></tr><tr><td>1.0 N HCl</td><td>西格玛-奥德里奇公司</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>[H&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;]亮氨酸</td><td>Moraevk</td><td>MC672</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 管</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>339652</td><td>50 mL 圆锥形离心管</td></tr><tr><td>秒表</td><td>Heuer Microsplit</td><td>型号 1000</td><td>1/100 分钟</td></tr><tr><td>安乐死溶液</td><td>Vet One</td><td>H6438</td><td></td></tr><tr><td>Northern Light 精密照明器</td><td>Imaging Research 公司</td><td>型号 B95</td><td>荧光灯箱</td></tr><tr><td>Micro-NIKKOR 55mm f/2.8</td><td>尼康</td><td>1442</td><td>CDD 相机</td></tr></tbody></table>

体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

Quantitative Autoradiographic Method for Determination of Regional Rates of Cerebral Protein Synthesis In Vivo

蛋白质合成对于神经元功能的发育和维持至关重要，并参与神经系统中的适应性变化。此外，人们认为神经系统中蛋白质合成的失调可能是某些发育障碍的核心表型。在动物模型中准确测量脑内蛋白质合成速率，对于理解这些疾病具有重要意义。我们所建立的方法旨在用于清醒、行为正常动物的研究。该方法为定量放射自显影法，可同时获得脑内所有区域的合成速率。该方法基于使用示踪氨基酸L-[1-14C]-亮氨酸以及L-亮氨酸在脑内代谢行为的动力学模型。我们选择L-[1-14C]-亮氨酸作为示踪剂，是因为其不会产生额外的标记代谢产物。该示踪剂要么被掺入蛋白质中，要么迅速代谢生成14CO2，后者在脑内大量未标记的CO2池中被稀释。该方法及模型还可校正组织蛋白水解产生的未标记亮氨酸对蛋白质合成前体库的贡献。该方法具有足够的空间分辨率，可测定细胞层、神经毡层以及下丘脑和脑神经核团中的蛋白质合成速率。为了获得可靠且可重复的定量数据，严格遵循操作细节至关重要。本文将详细介绍利用定量放射自显影L-[1-14C]-亮氨酸法在活体条件下测定脑区特异性蛋白质合成速率的具体操作步骤。

此处展示了一项代表性实验，用于说明预先给予蛋白质合成抑制剂对rCPS的影响。在开始测定rCPS前30分钟，通过皮下注射给予成年雄性C57/BL6野生型小鼠生理盐水溶解的茴香霉素（100 mg/kg）。与给予溶剂对照的动物相比，茴香霉素处理组小鼠的rCPS几乎无法检测到（图4）。这些数据表明，体内放射自显影法使用L-[1-14C]-亮氨酸测定脑内蛋白质合成速率的方法是可靠的。
我们展示了一幅L-[1-14C]-亮氨酸放射自显影图，显示脑部四个层面的方法分辨率（图5）。图示为嗅球中的细胞层图 5A 和 B），海马体（图5C），以及小脑（<str...

蛋白质合成是&#160;细胞的一项关键生物学过程。在大脑中，该过程对适应性变化至关重要。测量完整大脑中的蛋白质合成速率需要仔细考虑方法学因素。本文介绍了L-[1-14体内脑区蛋白质合成速率测定的C-亮氨酸定量放射自显影法

蛋白质合成对于神经元功能的发育和维持是必需的，并参与神经系统中的适应性变化。此外，它……

通过测量脑内不同区域的蛋白质合成速率，可以追踪大脑对长期变化（如发育和神经可塑性过程中发生的变化）所产生的反应。我们的方法具有测量完全定量且可在清醒并正常活动的动物体内进行的优点。定量放射自显影技术可实现对所有脑区同时进行测量。本实验操作由本实验室的学士后研究员 Anita Torossian 和动物外科医生 Tianjian Huang 演示。开始此操作前，请按照文本方案中的说明进行手术准备工作。进入手术阶段后，使用手术剪刀从左侧大腿上内侧区域向头侧中线方向做一厘米长的切口，暴露股动脉和股静脉。使用手术皮肤拉钩在切口上方及两侧牵拉松弛的皮肤。通过胶带将皮肤拉钩固定于手术台上。向暴露区域滴加无菌 0.9% 氯化钠溶液，以保持适当的湿润度。使用镊子进行钝性分离，剥离股动脉和静脉周围一小段区域的结缔组织。仔细分离动脉与静脉。然后使用镊子在切口最外侧位置，将一根可吸收缝线穿过股静脉和股动脉的下方。将缝线拉至一半，使两端长度相等。在更靠近腹股沟的近端位置，使用镊子将第二根缝线仅穿过股静脉下方。轻轻打一个半结，用于限制血流。在A股与B股之间的位置，用镊子将第三根缝线仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个完整的结，用于限制血流。注意不要撕裂静脉。轻轻牵拉B端以阻断血流。使用止血钳轻轻牵拉B端，维持血流阻断状态。随后，将PE导管未剪断的一端连接至32号针头及装有肝素化生理盐水的1毫米注射器。冲洗导管以去除气泡。用显微剪刀在股静脉受限区域剪开一个小孔，将已冲洗过的PE-8导管的斜端朝向B线小心插入。插入后，松开B线的张力，并继续将导管沿静脉向上推进。在包含导管的静脉周围收紧B线。使用C股线在导管上再打一个结。确保此结不缠绕股动脉。轻轻回拉注射器筒，使管路部分充满血液，以确认导管已正确植入，然后采用相同方法将PE 10导管插入左侧股动脉。固定股静脉和股动脉导管后，将A线在两根导管周围打结。剪除所有多余的缝线并移除皮肤牵开钩后，用肝素化生理盐水冲洗动脉导管以防止凝血。电灼两根导管的末端以形成密封。将小鼠置于俯卧位，在颈部基部做一小切口，并向暴露区域施加生理盐水。从颈部切口至股部切口皮下插入一根中空金属杆。将导管经中空金属杆内穿行，并从颈部切口引出。取出中空杆后，用缝线闭合股骨切口，随后给予术后镇痛。将导管穿过一段30厘米长的柔性中空管，形成弹簧套管，然后将弹簧套管的按钮缝合于皮下，再给予术后镇痛。将小鼠转移至带有旋转装置和悬臂的透明圆柱形容器中，用于恢复期间饲养小鼠。在容器下方放置一个暖手袋以保持小鼠体温。通过按照文本方案中详述的方法采集样本，确保小鼠在实验开始时处于正常的生理状态。为了静脉注射示踪剂，使用一个Y型连接器，其中一端连接装有碳14标记的亮氨酸示踪剂的注射器，另一端连接装有100至200微升无菌生理盐水的注射器，用于冲洗静脉管路。将Y型连接器连接至静脉管路。通过同时启动秒表、注射示踪剂并采集定时动脉血样本来开始研究。注射后立即用生理盐水冲洗静脉管路。以相同方式在实验开始后的前两分钟内连续采集1至7号血样。采集完7个样本后，每次采集剩余样本前均需先采集30微升死腔血液。8至14号样本分别在3、5、10、15、30、45和60分钟时采集。在实验过程中的某个时间点，按照文本方案所述，处理三支含有氚标记亮氨酸和正亮氨酸的内标管。为定量血浆中亮氨酸浓度，使用配备钠阳离子交换柱的高效液相色谱系统，并通过邻苯二甲醛进行柱后衍生化，结合荧光检测。亮氨酸色谱峰面积与样品中亮氨酸浓度成正比。通过与标准品比较来定量样品中的亮氨酸浓度。然后使用液体闪烁计数器定量血浆样品中氚（tritium）和碳-14（C 14）的每分钟衰变数。利用这些浓度数据绘制碳-14标记亮氨酸从循环系统中清除的清除曲线，以及其在动脉血浆中比活性随时间的变化过程。根据该图，计算动脉血浆中整合的 C 14 标记亮氨酸的比活性。为进行定量放射自显影，制备厚度为 20 微米的脑切片。使用冷冻切片机在 -20 °C 下对脑组织进行切片。将组织切片在明胶包被的载玻片上解冻贴附。载玻片固定后，将其与一组预先校准的C14标记甲基丙烯酸甲酯标准品一同置于X射线胶片暗盒中。在暗室安全光照条件下，将一张X射线胶片乳剂面朝下覆盖于载玻片和标准品上。封闭胶盒并将其放入黑色换膜袋中。根据制造商的说明进行胶片显影。不建议使用自动胶片显影，因为背景可能不均匀，从而影响定量分析。根据胶片上一组校准标准品的光密度值，绘制光密度与组织碳14浓度的校准曲线。将这些数据拟合为多项式方程。二次或三次多项式方程均可获得良好的拟合效果。为分析特定脑区，通过与脑图谱比对，在六至八个切片中定位感兴趣区域（ROI）。记录所有切片中 ROI 内各像素的光密度。根据标准曲线，计算每个像素的组织中碳-14浓度。最后，根据感兴趣区域（ROI）内组织平均的碳14浓度以及动脉血浆中非标记与标记亮氨酸浓度比值在时间 t 和 λ 时的积分，计算脑区蛋白质合成速率。该比值代表了组织前体池中来自血浆的亮氨酸所占的比例。此处展示的是经溶剂处理的动物与经蛋白质合成抑制剂茴香霉素处理的动物的代表性图像对比。蛋白质合成速率与图像中的灰度水平成正比。茴香霉素显著降低了脑内蛋白质合成的测定速率，表明该方法具有特异性。此处展示的是清醒活动小鼠在海马和下丘脑水平的数字化放射自显影图像。颜色较深的区域具有较高的局部脑蛋白合成速率。图中显示的是清醒且行为正常的对照组小鼠在背侧海马水平的数字化放射自显影图像。图像中脑蛋白合成速率根据右侧颜色条进行彩色编码。在进行该实验操作时，必须确保动物在测量过程中处于正常的生理状态。我们的方法已证明在脆性X综合征等神经发育障碍中存在蛋白质合成的失调。该方法也可能成为阿尔茨海默病等退行性病变和疾病状态的有用标志物。蛋白质合成方法可与免疫组织化学技术结合使用，在连续切片上交替进行，以关联蛋白质合成的变化与特定蛋白质的区域变化。总之，定量放射自显影L-1 C14亮氨酸方法适用于体内区域蛋白质合成速率的精确定量测定，在准确性及其对体内条件的适用性方面具有显著优势。

quantitative-autoradiographic-method-for-determination-regional-rates

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

定量自动放射法测定维沃脑蛋白合成区域速率

本视频展示了一种用于体外评估骨髓来源基质细胞摄取氨基酸的技术。钠离子（Na+）依赖性氨基酸转运蛋白介导放射性标记氨基酸进入细胞，通过测量放射活性来估算细胞对氨基酸的摄取量。...

放射性标记氨基酸摄取检测法用于定量细胞对氨基酸的摄取

小动物正电子发射断层扫描能够评估大脑的两种主要能量底物：葡萄糖和酮体。 在本方法中，依次向每只动物注射11C-乙酰乙酸盐和18F-氟脱氧葡萄糖，并根据磁共振图像确定的特定脑区，定量测量它们的摄取情况。...

一种用于定量测量大鼠脑区能量底物摄取的双示踪剂PET-MRI方案

神经元膜运输动态调控质膜蛋白的可用性，并显著影响神经传递。 迄今为止，在成年神经元中测量内吞运输仍具挑战性。 本文中，我们描述了一种高效且定量的方法，可在急性脑切片中体外（ex...

脑片生物素化：一种 离体 成年神经元中区域特异性血浆膜蛋白运输的测量方法

本文介绍了一种通过定量、密度测定法、体外受体放射自显影技术，使用碘-125标记的血管紧张素II类似物，来描述血管紧张素II...

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我们介绍一种用于测量[14C]-碘代安替比林（IAP）摄取并评估参与中枢性卒中后疼痛（CPSP）的神经底物激活情况的实验方案，该方案适用于啮齿类动物模型。...

脑卒中后中枢性疼痛大鼠脑内[14C]-碘安替比林的放射自显影测量

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放射自显影作为一种简单而强大的药理学靶点可视化与表征方法

本文介绍了一种定量分析方法，通过免疫荧光染色、共聚焦显微镜和计算机辅助分析，确定突触蛋白相对于标记蛋白的分布情况。...

使用免疫荧光法量化小鼠脑内突触蛋白的异质性分布

本文介绍一种利用近红外染料结合免疫组织化学与高分辨率扫描，检测脑区蛋白质的实验方案。...

利用近红外荧光与高分辨率扫描检测啮齿类动物脑组织中的蛋白质表达

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。...

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

本方法介绍了一种利用急性脑切片检测内源性单胺类物质释放的简单技术。该实验装置采用一个48孔板，其中包含用于单胺释放的组织固定装置。释放的单胺类物质通过高效液相色谱法（HPLC）结合电化学检测进行分析。此外，该技术还可作为药物发现的筛选方法。...

一种基于孔板的急性脑切片内源性单胺释放量检测方法

本实验方案描述并比较了对小鼠脑组织矢状切片进行全区域或特定感兴趣区域分析的步骤，以定量阿尔茨海默病APP/PS1转基因小鼠模型中的β-淀粉样蛋白负荷。...

小鼠脑切片上淀粉样蛋白β负荷的全脑与亚区域定量

学习定量放射自显影技术测定脑内蛋白质合成区域速率的方法，该技术使用L-[1-14C]-亮氨酸示踪剂在清醒活动动物中进行全定量测量，可同时检测多个脑区的神经可塑性变化。

体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

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