体内脑区蛋白质合成速率的定量放射自显影测定方法

通过测量脑内不同区域的蛋白质合成速率，可以追踪大脑对长期变化（如发育和神经可塑性过程中发生的变化）所产生的反应。我们的方法具有测量完全定量且可在清醒并正常活动的动物体内进行的优点。定量放射自显影技术可实现对所有脑区同时进行测量。

本实验操作由本实验室的学士后研究员 Anita Torossian 和动物外科医生 Tianjian Huang 演示。开始此操作前，请按照文本方案中的说明进行手术准备工作。进入手术阶段后，使用手术剪刀从左侧大腿上内侧区域向头侧中线方向做一厘米长的切口，暴露股动脉和股静脉。

使用手术皮肤拉钩在切口上方及两侧牵拉松弛的皮肤。通过胶带将皮肤拉钩固定于手术台上。向暴露区域滴加无菌 0.9% 氯化钠溶液，以保持适当的湿润度。

使用镊子进行钝性分离，剥离股动脉和静脉周围一小段区域的结缔组织。仔细分离动脉与静脉。然后使用镊子在切口最外侧位置，将一根可吸收缝线穿过股静脉和股动脉的下方。

将缝线拉至一半，使两端长度相等。在更靠近腹股沟的近端位置，使用镊子将第二根缝线仅穿过股静脉下方。轻轻打一个半结，用于限制血流。

在A股与B股之间的位置，用镊子将第三根缝线仅从股静脉下方穿过。轻轻打一个完整的结，用于限制血流。注意不要撕裂静脉。

轻轻牵拉B端以阻断血流。使用止血钳轻轻牵拉B端，维持血流阻断状态。随后，将PE导管未剪断的一端连接至32号针头及装有肝素化生理盐水的1毫米注射器。

冲洗导管以去除气泡。用显微剪刀在股静脉受限区域剪开一个小孔，将已冲洗过的PE-8导管的斜端朝向B线小心插入。插入后，松开B线的张力，并继续将导管沿静脉向上推进。在包含导管的静脉周围收紧B线。

使用C股线在导管上再打一个结。确保此结不缠绕股动脉。轻轻回拉注射器筒，使管路部分充满血液，以确认导管已正确植入，然后采用相同方法将PE 10导管插入左侧股动脉。

固定股静脉和股动脉导管后，将A线在两根导管周围打结。剪除所有多余的缝线并移除皮肤牵开钩后，用肝素化生理盐水冲洗动脉导管以防止凝血。电灼两根导管的末端以形成密封。

将小鼠置于俯卧位，在颈部基部做一小切口，并向暴露区域施加生理盐水。从颈部切口至股部切口皮下插入一根中空金属杆。将导管经中空金属杆内穿行，并从颈部切口引出。

取出中空杆后，用缝线闭合股骨切口，随后给予术后镇痛。将导管穿过一段30厘米长的柔性中空管，形成弹簧套管，然后将弹簧套管的按钮缝合于皮下，再给予术后镇痛。将小鼠转移至带有旋转装置和悬臂的透明圆柱形容器中，用于恢复期间饲养小鼠。

在容器下方放置一个暖手袋以保持小鼠体温。通过按照文本方案中详述的方法采集样本，确保小鼠在实验开始时处于正常的生理状态。为了静脉注射示踪剂，使用一个Y型连接器，其中一端连接装有碳14标记的亮氨酸示踪剂的注射器，另一端连接装有100至200微升无菌生理盐水的注射器，用于冲洗静脉管路。

将Y型连接器连接至静脉管路。通过同时启动秒表、注射示踪剂并采集定时动脉血样本来开始研究。注射后立即用生理盐水冲洗静脉管路。

以相同方式在实验开始后的前两分钟内连续采集1至7号血样。采集完7个样本后，每次采集剩余样本前均需先采集30微升死腔血液。8至14号样本分别在3、5、10、15、30、45和60分钟时采集。

在实验过程中的某个时间点，按照文本方案所述，处理三支含有氚标记亮氨酸和正亮氨酸的内标管。为定量血浆中亮氨酸浓度，使用配备钠阳离子交换柱的高效液相色谱系统，并通过邻苯二甲醛进行柱后衍生化，结合荧光检测。亮氨酸色谱峰面积与样品中亮氨酸浓度成正比。

通过与标准品比较来定量样品中的亮氨酸浓度。然后使用液体闪烁计数器定量血浆样品中氚（tritium）和碳-14（C 14）的每分钟衰变数。利用这些浓度数据绘制碳-14标记亮氨酸从循环系统中清除的清除曲线，以及其在动脉血浆中比活性随时间的变化过程。

根据该图，计算动脉血浆中整合的 C 14 标记亮氨酸的比活性。为进行定量放射自显影，制备厚度为 20 微米的脑切片。使用冷冻切片机在 -20 °C 下对脑组织进行切片。

将组织切片在明胶包被的载玻片上解冻贴附。载玻片固定后，将其与一组预先校准的C14标记甲基丙烯酸甲酯标准品一同置于X射线胶片暗盒中。在暗室安全光照条件下，将一张X射线胶片乳剂面朝下覆盖于载玻片和标准品上。

封闭胶盒并将其放入黑色换膜袋中。根据制造商的说明进行胶片显影。不建议使用自动胶片显影，因为背景可能不均匀，从而影响定量分析。

根据胶片上一组校准标准品的光密度值，绘制光密度与组织碳14浓度的校准曲线。将这些数据拟合为多项式方程。二次或三次多项式方程均可获得良好的拟合效果。

为分析特定脑区，通过与脑图谱比对，在六至八个切片中定位感兴趣区域（ROI）。记录所有切片中 ROI 内各像素的光密度。根据标准曲线，计算每个像素的组织中碳-14浓度。

最后，根据感兴趣区域（ROI）内组织平均的碳14浓度以及动脉血浆中非标记与标记亮氨酸浓度比值在时间 t 和 λ 时的积分，计算脑区蛋白质合成速率。该比值代表了组织前体池中来自血浆的亮氨酸所占的比例。此处展示的是经溶剂处理的动物与经蛋白质合成抑制剂茴香霉素处理的动物的代表性图像对比。

蛋白质合成速率与图像中的灰度水平成正比。茴香霉素显著降低了脑内蛋白质合成的测定速率，表明该方法具有特异性。此处展示的是清醒活动小鼠在海马和下丘脑水平的数字化放射自显影图像。

颜色较深的区域具有较高的局部脑蛋白合成速率。图中显示的是清醒且行为正常的对照组小鼠在背侧海马水平的数字化放射自显影图像。图像中脑蛋白合成速率根据右侧颜色条进行彩色编码。

在进行该实验操作时，必须确保动物在测量过程中处于正常的生理状态。我们的方法已证明在脆性X综合征等神经发育障碍中存在蛋白质合成的失调。该方法也可能成为阿尔茨海默病等退行性病变和疾病状态的有用标志物。

蛋白质合成方法可与免疫组织化学技术结合使用，在连续切片上交替进行，以关联蛋白质合成的变化与特定蛋白质的区域变化。总之，定量放射自显影L-1 C14亮氨酸方法适用于体内区域蛋白质合成速率的精确定量测定，在准确性及其对体内条件的适用性方面具有显著优势。