使用荧光寿命成像显微镜分析组织切片中的淀粉样蛋白结构

取一个组织切片，其中淀粉样蛋白聚集体代表异常蛋白质沉积。

组织用荧光染料七聚体-甲酰噻吩乙酸或hFTAA染色，它特异性地与淀粉样蛋白原纤维的β-折叠结构结合。

使用配备荧光寿命成像显微镜装置的共聚焦显微镜对载玻片进行成像，该显微镜测量染料分子的荧光寿命。

优化显微镜设置以有效激发染料分子。

当激光照射组织时，hFTAA 会激发并发出荧光。

致密结构中较强的染料结合导致较长的寿命，而在不太致密的结构中较弱的染料结合导致较短的寿命。

稍后，软件会生成聚合体的颜色编码图像。

红色和黄色等颜色出现在外围，表明荧光寿命较短，反映了不太紧凑、不稳定的淀粉样蛋白结构。

而核心中的蓝色和绿色等颜色代表较长的荧光寿命，反映出更紧凑和稳定的淀粉样蛋白结构。

染色当天，将切片浸入 99% 乙醇、70% 乙醇、dH_2O 和 PBS 的连续浴中 10 分钟，每次 10 分钟，然后让组织切片在环境条件下干燥。当组织干燥时，通过在PBS中稀释原液1至10,000来制备HFTAA的工作溶液。当组织干燥时，将HFTAA工作溶液的液滴添加到每个组织切片中以覆盖它。在室温下孵育30分钟。

用 500 微升 PBS 冲洗掉染色溶液，然后将载玻片浸入 PBS 浴中 10 分钟。让切片在环境条件下干燥后，使用荧光封片剂进行封片。让封片剂沉淀过夜。

淀粉样蛋白检测可以在安装后直接进行，甚至可以在不安装的情况下进行。然而，如果实验的目标是收集高质量的光谱信息，则优选过夜孵育。

显微镜切换到FLIM模式，将针孔设置为20，激发波长设置为490纳米，激光强度设置为0.5%。使用 40 兆赫兹的脉冲激光器。在 FLIM 软件中，设置超过 550 纳米的光子计数。在 显示参数（Display Parameters） 窗口中，按照光子计数进行作，直到最大计数约为4000个光子计数。保存文件并将其导出为 SPC 图像。