利用荧光寿命成像显微镜分析组织切片中的淀粉样结构

取一块含有淀粉样蛋白聚集物的组织切片，该聚集物代表异常的蛋白质沉积。

组织用荧光染料七聚体甲酰基噻吩乙酸（heptamer-formyl thiophene acetic acid）或 hFTAA 进行染色，该染料可特异性结合淀粉样纤维的β-折叠结构。

使用配备荧光寿命成像显微镜单元的共聚焦显微镜对载玻片进行成像，该单元用于测量染料分子的荧光寿命。

优化显微镜设置，以实现对染料分子的有效激发。

当激光照射组织时，hFTAA 被激发并产生荧光。

致密结构中染料结合更强，导致寿命更长；而较松散结构中染料结合较弱，导致寿命更短。

随后，软件会生成聚集体的彩色编码图像。

红色和黄色等颜色出现在周边区域，表明较短的荧光寿命，反映出较不紧密、不稳定的淀粉样蛋白结构。

核心区域中的蓝色和绿色等颜色代表较长的荧光寿命，反映出更致密且稳定的淀粉样蛋白结构。

染色当天，将切片依次浸入99%乙醇、70%乙醇、dH₂O和PBS中，每种溶液各10分钟，然后在常温下自然晾干组织切片。在组织干燥期间，用PBS将HFTAA储存液按1:10,000比例稀释，配制工作液。组织干燥后，将HFTAA工作液滴加至各组织切片上，确保完全覆盖。室温孵育30分钟。

用 500 微升 PBS 洗去染色液，然后将玻片浸入 PBS 溶液中孵育 10 分钟。让切片在室温条件下自然干燥后，使用荧光封片剂封片。封片剂需静置过夜使其充分固化。

淀粉样蛋白检测可在封片后直接进行，甚至无需封片即可完成。然而，如果实验目的是获取高质量的光谱信息，则建议进行过夜孵育。

将显微镜切换至荧光寿命成像模式（FLIM），设置针孔为20，激发波长为490纳米，激光强度为0.5%。使用40兆赫的脉冲激光。在FLIM软件中，设置在550纳米以上进行光子计数。在显示参数窗口中，持续监测光子计数，直至最大计数达到约4,000个光子计数。保存文件并将其导出为SPC图像。