荧光寿命成像显微镜观察细胞内圈套的贩运

本实验的总体目标是可视化活细胞中 SNARE 蛋白的复杂形成。该方法可以帮助回答膜运输领域的关键问题，例如识别催化特定细胞器运输步骤的 SNARE 蛋白集。该技术的主要优点是它允许直接可视化 SNARE 参与复合物形成的细胞位置。

在本实验中，将 900， 000 个 HeLa 细胞分装在三个 Eppendorf 管中进行转染。按照文本方案中的说明使用以下构建体转染细胞。1 号样品使用 syntaxinin-4 mCitrine 构建体，2 号样品使用 syntaxinin-4 mCitrine 和 VAMP3-mCherry，3 号样品使用 syntaxinin-3 与 mCitrine 和 mCherry 融合。

37 摄氏度和 5% CO2 中提供 10% FCS 和 1% 抗生素抗mico剂的高葡萄糖 DMEM 中培养转染细胞过夜。第二天，吸出培养基，并用活细胞成像培养基洗涤细胞一次，每次 2 分钟。之后，将细胞置于新鲜的成像培养基中。

要开始此过程，请将 2 号样品置于 37 摄氏度的加热台上，置于时域荧光寿命成像共聚焦显微镜下，该显微镜具有用于供体荧光团和时间分辨数据采集的脉冲激发源。在每次荧光寿命成像显微镜或 FLIM 测量之前，选择一个具有 mCitrine 和 mCherry 标记的 SNARE 蛋白可见表达的细胞，并记录 256 x 256 像素的共聚焦图像，同时激发两个荧光团。通过单击运行 FLIM 来记录 FLIM 图像，其中 FLIM 图像以与之前记录的共聚焦图像相同的尺寸和空间分辨率进行记录。

记录图像时至少需要 50， 000 个光子用于全细胞 FLIM 分析，或每个像素至少 400 个光子。请务必在距离玻璃表面至少 1 微米的地方记录 FLIM 测量值，以避免反射视图。对 2 号样品中的多个细胞以及 1 号样品和 3 号样品中的细胞重复成像。

接下来，将干净的玻璃盖玻片放在显微镜载物台上，以记录仪器响应函数或 IRF。将发射检测器的光栅调谐到激发波长，然后单击按钮运行 FLIM 以记录 FLIM 图像，其中玻璃盖玻片的背散射。照片记录将使用 PT32ICS 转换软件转换为 FLIM 图像。

配置软件。将 output 设置为 ImageJ 以生成 FLIM 图像。将图像大小设置为 256 x 256 像素，将通道设置为 2。

按 convert 并加载一个或多个光子轨迹。按住 Ctrl 键可选择多个光子轨迹。FLIM 图像应在保存光子轨迹的同一文件夹中生成。

首先打开能够拟合反卷积的数据分析软件程序。导入包含每个光子轨迹的直方图的文本文件。重新组织表，使 IRF 位于表的第二列，在 A 列中的时间值旁边。通过选择所有列来确定记录的光子轨迹的质量。

不要分析具有高反射峰的光子轨迹。此处显示了一个示例。使用 Ctrl 键选择包含将要拟合的质量控制寿命直方图的所有列，以及列 B 中的 IRF，然后加载非线性拟合。

通过将 deconvoluted fit 函数添加到分析软件中来加载该函数。选择 fit 函数文件。该函数使用用 IRF 去卷积的单指数衰减函数拟合荧光寿命直方图。

对拟合曲线执行 X 轴缩放。按 fit 拟合曲线。这将转换拟合并在阵列中生成一份报告表，其中的表格包含荧光寿命、偏移量和振幅。

它还将生成一个数据表，其中包含拟合曲线和拟合残差。显示的是 helocells 的代表性共聚焦图像，其中仅表达 mergein four mCitrine、snytaxin four mCitrine 和 VAMP3 mCherry 或 syntaxin three mCitrine mCherry 串联构建体。在这些随附的荧光寿命图像中，颜色表示平均表观荧光寿命。

然后将图像与 mCitrine 供体荧光团的荧光强度进行混淆。接下来是用双指数衰减函数拟合的相同图像。像素颜色表示与 VAMP3 复合的 syntaxin four 的估计分数。

使用玻璃水界面上的背向散射来测量设置的仪器响应函数。对于仅表达 Syntaxin 4 mCitrine、在 4 mCitrine 中共表达 Syntaxin 与 VAMP3 mCherry 以及表达 Syntaxin 3 mCitrine mCherry 串联构建体的细胞，显示了全细胞寿命直方图。图 E 显示了图 B、C 和 D 的衰减曲线的叠加图，嵌体显示相同的图形，但 Y 轴具有对数刻度。

记录的荧光寿命直方图太靠近显微镜盖玻片表面会导致反射峰较大，如黄色阴影区域所示。最后，显示了具有代表性拟合和双指数衰减函数的寿命直方图。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在两到四个小时内完成。

在尝试此过程时，请务必记住记录多个细胞，而供体和拦截子 SNARES 的表达水平会影响寿命。按照此程序，可以激活细胞，以回答与 SNARE 介导的膜运输重新生根相关的细胞类型特异性问题。开发后，这项技术为膜运输领域的研究人员探索所有真核细胞中细胞器运输的细胞间途径铺平了道路。

观看此视频后，您应该对如何记录和分析 FLIM 数据有很好的了解。不要忘记，使用转基因生物和高功率激光器可能非常危险，在尝试此程序时应始终采取预防措施，例如手套和护目镜。