Name: 活细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的FLIM-FRET测量。 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学习使用FLIM-FRET技术在活铜绿假单胞菌中测量蛋白质-蛋白质相互作用的方法。本方案特别适用于分析供体与受体表达水平不平衡的情况，可直接在活细胞环境中验证预测的蛋白相互作用。

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我们感谢 Ludovic Richert 博士在荧光寿命成像（FLIM）数据采集方面的宝贵帮助，以及对 FLIM 系统的技术维护与开发工作。本研究由法国化学研究基金会（https://icfrc.fr/）的资助项目提供经费支持。VN 由法国医学研究基金会（FRM‐SPF201809006906）资助。YM 感谢法国大学研究院（IUF）提供的支持及其为科研工作所额外给予的时间。IJS 和 JG 感谢斯特拉斯堡药物递送研究所提供的经费支持。

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作者无任何利益冲突需要披露。

与基于荧光强度的FRET成像相比，FLIM-FRET具有一些关键优势。荧光寿命是荧光团的内在参数，因此既不依赖于荧光团的局部浓度，也不依赖于激发光的强度。此外，荧光寿命受光漂白的影响也较小。在细胞内蛋白质浓度在亚细胞区室或区域间高度异质的情况下，FLIM-FRET特别适用于检测蛋白质相互作用（PPIs）。当蛋白复合物浓度较低，或两种蛋白中至少一种蛋白的表达水平较低时，FLIM-FRET在所有此类情况下均具有应用价值。
在蛋白质相互作用（PPIs）的背景下，仅通过平均寿命来推断导致寿命缩短的FRET机制以及相互作用性质的信息是困难的。事实上，平均寿命的缩短可能是由于大量以中等FRET效率发生相互作用的组分所致，也可能是相反的情况，即仅有少量供体与受体在很短的距离内发生相互作用。当形成化学计量比不平衡的复合物时，情况变得更加复杂。能够同时展示多个维度信息的图形可视化工具（例如在图示中展示tau1、alpha和&#60;tau&#62;）有助于提供有关所形成复合物性质的关键信息。此外，在此背景下，其他数据可视化方式也具有重要意义，例如基于相量分析的方法...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）调控细胞内的多种关键过程1。PPI的功能取决于蛋白质的组成、亲和力、功能以及在细胞内的定位2。可通过多种技术手段研究PPI3。例如，共免疫沉淀是一种相对简单、稳健且经济的方法，常用于鉴定或验证PPI。然而，当相互作用的蛋白质表达水平较低，或其相互作用是瞬时的，或仅在特定环境中发生时，研究PPI可能具有挑战性。研究铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中绿脓菌素合成通路不同酶之间的PPI，需要解除铁依赖性全局阻遏蛋白Fur的抑制作用，以使绿脓菌素通路的所有蛋白质在细胞内得以表达4,5,6。该通路中所有蛋白的共同调控机制可实现其在细胞内适时表达，从而促进它们之间的相互作用。由于该代谢通路中的蛋白质在大小、性质、表达水平及数量上具有高度多样性，因此在重建系统中对其进行研究较为困难6。因此，在细胞环境中研究PPI对于深入理解蛋白质在其天然背景下的生物学功能至关重要。
仅有少数方法（包括荧光技术）可用于在活细胞中研究蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）7。在可测量的不同荧光参数中，荧光寿命（即荧光分子在发射光子前处于激发态的平均时间）可能是用于在活细胞中进行研究的最有意义的参数之一。荧光分子的荧光寿命对其所处环境高度敏感，因此荧光寿命成像显微技术（FLIM）可提供有关荧光分子周围环境的化学或物理信息8。这包括 Förster 共振能量转移（FRET）现象，当一个荧光“受体”位于荧光“供体”附近时即可发生能量转移。能量转移会导致供体荧光寿命显著缩短（图 1A），使得荧光寿命成像显微技术（FLIM）成为在活细胞中直接研究蛋白质-蛋白质相互作用的有力手段。此外，FLIM 还可提供有关相互作用在细胞内发生位置的空间信息7,8。该方法在两种相互作用蛋白均可被荧光标记的情况下，对研究蛋白质-蛋白质相互作用具有极强的应用价值。
要发生FRET，两个荧光团之间的距离必须满足关键条件8,9。两个荧光团之间的距离不得超过10 nm。因此，在设计FLIM-FRET实验时必须谨慎，以确保荧光供体和受体在相互作用的复合物中有机会彼此靠近。尽管这看似具有限制性，但实际上这是一个显著优势，因为FRET的距离依赖性可确保发生FRET的两个标记蛋白必须发生直接的物理相互作用（图1A）。因此，与共定位实验中难以明确判断蛋白质相互作用（两个共定位的蛋白质未必发生相互作用）不同，FLIM-FRET不存在此类问题。
<img alt="荧光共振能量转移示意图；带有强度重叠图的FRET过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61602/61602fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：FLIM-FRET分析原理。FLIM-FRET多维图像的每个像素都包含在此特定位置记录的荧光衰减信息（#counts = 通道t中检测到的光子数）。(A) FLIM图像的经典表示通常为伪彩色编码的二维寿命图像（左图）。当发生FRET时，可观察到供体平均荧光寿命降低——表现为颜色标尺的变化——这提示该空间区域内存在蛋白质相互作用（PPIs）。(B) FRET的发生需要供体发射光谱与受体吸收光谱之间存在重叠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61602/61602fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
FRET 的第二个要求是，供体的发射光谱与受体的吸收光谱应存在重叠8（图1B）。供体的荧光激发波长应选择在对受体产生直接荧光激发贡献极小的范围内。并非所有荧光团组合都适用，我们还建议优先选用具有单指数荧光衰减特性的供体，以利于对 FLIM-FRET 结果进行解释10。已有多种荧光蛋白组合满足这些条件，其中包括常用的 eGFP-mCherry 组合11（有关可用荧光蛋白 FRET 配对的综述，参见12,13）。
荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术能够在FLIM图像的每个像素点上测量FRET供体的荧光寿命衰减（图1A）。目前有两种主要技术用于测定荧光寿命，它们在数据采集和分析方法上有所不同：频域法（FD）14和时域法（TD）。时域FLIM应用更为广泛，通常采用脉冲光源照射，并结合多种可能的检测配置，包括门控方法15、条纹相机16或时间相关单光子计数（TCSPC）技术8。无论是频域还是时域技术，荧光寿命并非直接测量获得，而是需要对所测数据进行分析，以估算寿命值或判断分子间相互作用的存在。对于TCSPC技术，最常用的分析方法是通过最小二乘迭代反卷积法，将衰减曲线拟合为单指数或多指数函数，从而最小化残差的加权和。
最后，荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）既可采用单光子激发，也可采用多光子激发。多光子激发具有多种优势，例如可减少焦平面外的自发荧光和光损伤。当处理较厚的三维样品时，多光子激发还能够实现更长的激发深度8。相比之下，单光子激发通常效率更高，因为荧光蛋白的双光子吸收截面有限17。
本文提出了一种在活体P. aeruginosa中进行FLIM-FRET检测蛋白质相互作用（PPIs）的实验方案，特别针对表达拷贝数差异显著的两种相互作用蛋白（PvdA与PvdL），以展示该技术在揭示PPI关键特征方面的高质量与稳健性。PvdA和PvdL蛋白参与绿脓菌素（pyoverdine）的生物合成过程。PvdA是一种L-鸟氨酸N5-加氧酶，通过羟基化（PvdA）和甲酰化（PvdF）反应将L-鸟氨酸转化为L-N5-甲酰-N5-羟基鸟氨酸18。PvdL是一种非核糖体肽合成酶（NRPS），由四个模块组成：第一模块催化肉豆蔻酸的酰化反应；第二模块催化L-谷氨酸的活化及其与肉豆蔻酰辅酶A的缩合；第三模块缩合一个L-酪氨酸残基，并将其异构化为D-酪氨酸；最后，第四模块结合一个L-Dab（二氨基丁酸）氨基酸，形成酰化的三肽L-Glu/D-Tyr/L-Dab6。因此，PvdL负责绿脓菌素前体中前三个氨基酸的合成。PvdA蛋白与PvdL之间的相互作用令人意外，因为与PvdI和PvdJ不同，PvdL并不含有专门识别L-N5-甲酰-N5-羟基鸟氨酸的模块。这一相互作用提示，所有参与绿脓菌素前体生物合成的酶可能组装成大型、短暂且动态的多酶复合物19,20。
本报告详细介绍了如何构建表达天然状态下的两种相互作用蛋白（分别标记为 eGFP 和 mCherry）的细菌菌株。我们还描述了样品制备方法以及高效进行 FLIM-FRET 细胞成像的实验条件。最后，我们提供了一步一步的图像分析教程，包括一种新近开发的工具，该工具可实现高级可视化，便于直观解读复杂的 FLIM-FRET 数据。通过本报告，我们希望不仅能够说服富有探索精神的研究者，更希望让大多数生物学家相信，FRET-FLIM 是一种可及且强大的技术，能够在天然细胞环境中直接回答有关蛋白质相互作用（PPIs）的问题。

<table><tbody><tr><td>525/50 nm 带通滤光片</td><td>F37-516, AHF, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>680 nm 短通滤光片</td><td>F75-680, AHF, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铵 (NH4)2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq DNA 聚合酶 5U/&amp;mu;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EP0714</td><td></td></tr><tr><td>E. coli TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>光纤耦合雪崩光电二极管</td><td>SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片（1.5号厚度，20&amp;times;20 mm）</td><td>Knitel glass</td><td>MS0011</td><td></td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶Phusion 2U/&amp;mu;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>LB培养基（Lysogeny broth）</td><td>Millipore</td><td>1.10285</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁 (MgSO4 · 7H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片（25&amp;times;75 mm）</td><td>Knitel glass</td><td>MS0057</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 凝胶和PCR产物纯化试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.50</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin 质粒提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.10</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES20765</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾 (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸钠（二钠盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14160</td><td></td></tr><tr><td>SPCImage，SPCM软件</td><td>Becker &amp;amp; Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌接种环</td><td>Nunc</td><td>7648-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 1U/&amp;mu;L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15224017</td><td></td></tr><tr><td>TCSPC模块</td><td>SPC830, Becker &amp;amp; Hickl, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti:Sapphire激光器</td><td>Insight DeepSee, Spectra Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

活体细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的荧光寿命成像-荧光共振能量转移测量

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）调控细胞内的多种关键过程。荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合 Förster 偿能共振转移（FRET）可提供关于活细胞中蛋白质相互作用的精确信息。FLIM-FRET 技术依赖于测量 FLIM 图像每个像素点上 FRET 供体的荧光寿命衰减，从而定量且准确地揭示蛋白质相互作用及其在细胞内的空间组织特征。本文提出了一种详细的 FLIM-FRET 测量实验方案，我们已将其应用于监测活体Pseudomonas aeruginosa中的蛋白质相互作用，特别针对两种表达拷贝数差异显著的相互作用蛋白，以展示该技术在揭示蛋白质相互作用关键特征方面的高质量与稳健性。本方案详细描述了表征蛋白质相互作用所需的全部步骤——从细菌突变株的构建，到利用最新开发的分析工具对复杂 FLIM-FRET 数据进行直观可视化和最终分析的全过程。

不同细菌菌株的荧光寿命测得值的经验累积分布函数（ecdf）如图所示 图8如果发生FRET，ecdfs将向较短的寿命方向移动（图8A,8B）。需要注意的是，当两种蛋白质相互作用导致两个荧光基团之间距离较远时，不会发生FRET（荧光共振能量转移）图8C）。在荧光寿命成像（FLIM）中，这种情况无法与两个分子之间完全无相互作用的情形相区分。因此，当无法根据分子模型或已知的复合物结构预测染料间距离时，重要的是考虑在蛋白质的不同位点进行标记，以最大化检测相互作用的可能性。同样，由于PvdA（高表达）与非核糖体肽合成酶PvdL（每细胞仅少数拷贝）之间的蛋白表达量存在显著差异，相同的PvdA/PvdL复合物不会产生相似的FLIM-FRET数据。事实上，不平衡的化学计量比会使FLIM-FRET数据的解释变得复杂。具体而言，取决于哪种蛋白被供体染料标记，化学计量比的不平衡会导致在记录的荧光寿命分布中，游离的与结合的供体标记蛋白所占比例出现差异。...

本文介绍了一种利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术，在活体Pseudomonas aeruginosa中表征两种表达水平差异极大的蛋白质之间相互作用的实验方案。该方案包括细菌菌株构建、细菌固定、成像以及成像后数据分析流程。

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）调控细胞内的多种关键过程。荧光寿命成像显微技术（FLIM）结合Förster...

FILM-FRET 是一种强大的技术，可用于验证疑似或预测的蛋白质-蛋白质相互作用。在本方案中，我们介绍了一种在供体与受体数量不平衡的特定情况下分析数据的方法。FILM-FRET 能够直接在活细胞中提供有关蛋白质-蛋白质相互作用的信息。在天然细胞环境中研究蛋白质-蛋白质相互作用非常重要，尤其是在荧光蛋白以内源水平表达的情况下。首先，在30摄氏度下，将铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）、大肠杆菌TOP10（E.coli TOP10）和大肠杆菌辅助菌（E.coli helper）分别在5毫升不含抗生素的LB培养基中振荡培养过夜。次日，测定各培养物的光密度，并在1.5毫升微量离心管中等量混合铜绿假单胞菌、大肠杆菌TOP10和大肠杆菌辅助菌。将离心管在9,300 × g条件下离心五分钟以沉淀细菌，弃去上清液，并将沉淀重悬于50 µL LB培养基中。取少量混合物接种于预热的LB琼脂平板上，于37 °C培养5小时。培养结束后，用无菌接种环刮取菌斑，并将其重悬于1 mL LB培养基中。取100 µL该细菌悬液接种于含有10 µg/mL氯霉素和30 µg/mL庆大霉素的LB琼脂平板上，于37 °C培养两天，以消除大肠杆菌TOP10和辅助大肠杆菌。挑取单菌落重悬于1 mL LB培养基中，于37 °C以振荡培养4小时，然后将离心管在9,300 × g条件下离心3分钟，弃去950 µL上清液。将沉淀重悬于50微升LB培养基中，并将混合物涂布于含有蔗糖且不含氯化钠的LB琼脂平板上。在30摄氏度下过夜培养。挑取分离的单菌落，分别点种于LB琼脂平板和含有15毫克/毫升庆大霉素的LB琼脂平板，以检测其对庆大霉素的敏感性。将显微镜玻片放置在平坦的水平表面上，并在其周围放置两个顶部贴有两层胶带的玻片。用移液器吸取70 µL 1%熔化的琼脂糖，滴加到玻片上，然后将第四个玻片盖在上面以压平琼脂糖液滴。轻轻按压约一分钟。取下上层载玻片，在琼脂糖垫上不同位置滴加约三微升细菌液，共三至四处。用显微镜盖玻片覆盖琼脂糖垫，并用熔化的石蜡从四个角开始固定，将其密封在载玻片上。将显微镜载玻片放置于载物台上，使盖玻片朝向物镜。将滤光立方体转盘旋转至选择 eGFP 滤光片，打开荧光灯快门，使荧光光源导向显微镜目镜。使用显微镜调焦旋钮将物镜对准细菌。利用控制电动载物台的操纵杆，在样品中选择感兴趣的区域。将荧光发射光路重新导向检测器，然后转回滤光片转轮，选择用于930纳米激光的二向色镜立方体，并将激光功率设置为20毫瓦。将感兴趣区域的大小设置为30微米，该参数可调节驱动检流计镜的电压，并确定其运动范围。打开检测器并开始扫描样品。通过计算机界面微调载物台位置来选择成像视野。此操作可在设置过程中通过移动显微镜控制软件图像上的十字标记以定义图像的新中心，然后点击“移动载物台”完成。用于采集的理想视野应包含10至30个静止且均处于清晰对焦状态的细菌。如果希望提取单细胞FILM-FRET数据，请确保细菌充分分散为单个细胞。打开成像软件，检查光子计数率是否不过高，以避免可能影响荧光寿命测量的堆积效应。如有必要，降低激光强度以保持较低的光子计数率。调整采集参数，包括采集时间。按下开始按钮，等待采集完成。要分析数据，请打开 RStudio 并创建一个新项目。在主项目文件夹中创建一个新文件夹，并将其命名为 data，然后将所有分析 ask 文件移入该文件夹中。打开一个新的脚本文件或补充脚本 flim_analysis.r。安装用于荧光寿命数据分析的专用 FlimDiagRam 软件包，并在工作空间中调用该软件包。此处展示了针对不同细菌菌株测得的荧光寿命的实测累积分布函数。如果发生FRET，则这些函数会向较短的寿命方向偏移。需要注意的是，当两种蛋白质相互作用导致两个荧光团之间距离较远时，FRET无法发生，这种情况无法与无相互作用的情形相区分。因此，可能需要在不同位点标记蛋白质，以最大限度地提高探测相互作用的可能性。由于 PvdA 与 PvdL 之间的蛋白表达量存在显著差异，相同的复合物无法产生相似的 FILM-FRET 数据。化学计量比的不平衡导致在记录的荧光寿命分布中，游离的与结合的供体标记蛋白的贡献存在差异。该图可用于提供有关化学计量比的关键信息。在 PvdA-eGFP mCherry-PvdL 突变体中，标记为供体的 PvdA 数量远高于 mCherry-PvdL 的数量。在样品中存在的所有供体中，仅有少数与 PvdL 发生相互作用。约位于2.3纳秒的单一tau1值表明，每个PvdA-eGFP供体只能与一个mCherry-PvdL受体发生能量转移。当标记方式反转时，大多数eGFP-PvdL蛋白预期会与PvdA-mCherry相互作用，这由较高的α1值得以证实。tau1值分布更广，提示多个PvdA蛋白可能结合到单个PvdL蛋白上。FLIM 系统正越来越多地出现在各类成像平台中。FILM-FRET 样本的成像操作并不比视频显微成像更复杂。

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科研

JoVE Journal

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生物学

活细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的FLIM-FRET测量。

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蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

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使用单分子生物传感器通过FRET显微镜实时监测活细胞中的信号事件

该视频介绍了利用荧光寿命成像-荧光共振能量转移（FLIM-FRET）技术，在表达带有荧光蛋白标记的胞质蛋白（供体eGFP和受体mCherry）的活细菌中检测蛋白质-蛋白质相互作用的方法。该联合技术还可实现对相互作用蛋白的定量分析。...

利用FLIM-FRET成像表征活体细菌中的蛋白质-蛋白质相互作用

光激活定位显微镜（PALM）结合单分子示踪技术，可直接观察并定量活体大肠杆菌（Escherichia...

利用光激活单分子示踪技术在活体细菌细胞中可视化蛋白质-DNA相互作用

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

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近年来，已开发出多种基于FRET的力学生物传感器，能够实现对细胞内力的蛋白质特异性解析。在本方案中，我们演示了如何使用一种针对核骨架-细胞骨架（LINC）复合物蛋白Nesprin-2G的连接区设计的传感器，来测量作用于细胞核LINC复合物上的肌动球蛋白力。...

使用 Förster 共振能量转移（FRET）力生物传感器测量细胞核 LINC 复合物跨膜机械力的实验方案

本文介绍了一种实验方案，可同时利用基于荧光共振能量转移的张力传感器测量蛋白质所受载荷，并结合光漂白后荧光恢复技术测量蛋白质动态，从而实现对活细胞内受力敏感的蛋白质动态进行定量分析。...

利用荧光技术组合测量活细胞中力敏感蛋白的动力学

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利用体外荧光共振能量转移研究蛋白质复合物在毫秒时间尺度上的动态变化

本文提供了使用高分辨率荧光显微镜研究枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

活细胞荧光显微镜技术用于研究细菌中亚细胞蛋白定位及细胞形态变化

两种荧光分子之间的弗ör斯特共振能量转移（FRET）可用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。本文提供了一种通过共聚焦激光扫描显微镜检测受体的敏化发射以及供体分子的淬灭来测量活细胞中FRET的实验方案。...

利用FRET敏化发射在活细胞中评估蛋白质相互作用

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生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

学习使用FLIM-FRET技术在活铜绿假单胞菌中测量蛋白质-蛋白质相互作用的方法。本方案特别适用于分析供体与受体表达水平不平衡的情况，可直接在活细胞环境中验证预测的蛋白相互作用。

活体细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的荧光寿命成像-荧光共振能量转移测量

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