活细菌中蛋白质-蛋白质相互作用的FLIM-FRET测量。

FILM-FRET 是一项强大的技术，可以确认可疑或预测的蛋白质-蛋白质相互作用。在此协议中，我们提出了一种分析不平衡捐赠者和接受方数量特定情况下数据的方法。FILM-FRET 能够直接提供有关活细胞中蛋白质-蛋白质相互作用的信息。

研究原生细胞环境中的个人蛋白相互作用非常重要，特别是在荧光蛋白在内源水平上表达时。首先，在5毫升LB中种植P.aeruginosa、大肠杆菌 TOP10和大肠杆菌，在30摄氏度下无抗生素，同时在夜间摇晃。第二天，测量培养物的光学密度，在1.5毫升微管中混合同等数量的P.aeruginosa、大肠杆菌 TOP10和大肠杆菌帮助剂。

在9，300倍G下将管离心5分钟，以对细菌进行颗粒化，然后丢弃上一代，将颗粒重新在50微升LB中。在预热的 LB agar 上镀一点混合物，并在 37 摄氏度下孵育 5 小时。孵育后，用无菌接种回路刮擦斑点，并在一毫升LB中重新暂停。这种细菌悬浮液的板100微升在LB agar上，每毫升氯霉素含有10微克，每毫升甘霉素含有30微克，在37摄氏度下孵育两天，以消除大肠杆菌 TOP10和大肠杆菌。将一个菌落重新用一毫升LB中孵育，在37摄氏度下孵育，轨道摇晃4小时，然后在9，300倍G下离心管3分钟，并丢弃950微升的上光。

将颗粒重新放入50微升LB中，将含有蔗糖和不含氯化钠的LB汞上的混合物分离。在30摄氏度下孵育板。在LB agar 和 LB agar 上发现含有每毫升 15 毫克的根霉素的分离菌落，以检查根霉素的敏感性。

将显微镜玻璃滑梯放在平面上，并排列两个玻璃滑梯，上面贴着两层胶带。将 70 微升 1% 的糖液滴滴到玻璃幻灯片上，将第四个滑轨放在顶部以压平阿加罗斯液滴。轻轻按下约一分钟。

脱下上部滑梯，在阿加罗斯垫的不同位置的三到四个地点放置大约三升细菌。用显微镜玻璃盖玻片盖住 agarose 垫，用融化的石蜡固定，从四角开始将其密封在玻璃滑梯上。将显微镜幻灯片放在舞台上，盖玻片朝向目标。

转动滤波立方体炮塔以选择 eGFP 立方体并打开荧光灯快门，然后将荧光灯向显微镜的目镜发送。使用显微镜旋钮将目标对焦于细菌。使用控制电动阶段的操纵手柄选择样品中感兴趣的区域。

将荧光发射路径送回探测器，然后返回滤波立方体炮塔，选择 930 纳米激光的二色立方体，将激光功率设置为 20 毫瓦。将感兴趣区域的大小设置为 30 微米，用于调节运行 galvo 反射镜的电压并定义其运动范围。打开探测器并开始扫描样品。

通过从计算机界面微调舞台，选择图像的视场。这可以通过在显微镜控制软件中移动图像上的十字来完成设置，该软件将定义图像的新中心并按下移动阶段。一个好的获取视野应该包含 10 到 30 个不动的细菌都放在焦点上。

如果有兴趣提取单细胞 FILM-FRET 数据，请确保细菌具有良好的个性化。打开成像软件并检查光子计数率是否过高，以避免产生可能影响寿命测量的堆积效应。如有必要，降低激光强度以保持光子计数率低。

调整采集参数，包括采集收集时间。按下启动按钮，等待采集完成。要分析数据，请打开 RStudio 并创建新项目。

在主项目文件夹中创建一个新文件夹并命名数据，然后将所有分析请求文件移动到此文件夹中。打开新的脚本文件或补充脚本flim_analysis.r.安装专用的 FlimDiagRam 封装进行胶片数据分析，并在工作区中调用该包。

此处显示了为不同细菌菌株测量的荧光寿命的累积分布函数。如果出现 FRET，则函数将转移到较短的生存寿命。需要注意的是，当两种蛋白质的相互作用导致两种荧光团之间距离很远时，FRET不会发生，这不能与缺乏相互作用区分开来。

因此，可能需要将蛋白质标记在不同位置，以最大限度地提高探测相互作用的机会。由于PvdA和PvdL之间的蛋白质表达差异很大，相同的复合物不会产生类似的膜-FRET数据。与记录的荧光寿命分布中结合的供体标记蛋白相比，不平衡的三分之一体化导致自由蛋白的贡献存在差异。

图表图可用于提供有关计量学的关键信息。在PvdA-eGFP mCherry-PvdL突变体中，捐赠者标记的PvdA的数量远远高于mCherry-PvdL的数量。在样本中所有捐赠者中，只有少数捐赠者正在与PvdL进行互动。

以大约 2.3 纳秒为中心的单个 tau 值表明，每个 PvdA-eGFP 捐赠者只能与一个 mCherry-PvdL 接受器一起转移。当标记反转时，大多数eGFP-PvdL蛋白预期与PvdA-mCherry相互作用，而较高的α值证实了这一点。tau一个值变得更加分散，表明多个PvdA蛋白可能与单个PvdL蛋白结合。

FLIM 设置在越来越多的成像设施中可用。FILM-FRET 中的成像样本并不比视频显微镜中的成像更为复杂。