Name: 用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像对发光共轭吩染色的淀粉样组织的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学习使用发光共轭吩染料hFTAA对淀粉样组织进行高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像的方法。该技术可检测朊病毒病和阿尔茨海默病动物模型中的蛋白质聚集体，具有高灵敏度和选择性，适用于临床诊断和科学研究。

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作者感谢Mikael Lindgren和Chanan Sluzny在荧光显微镜方面的建议，并感谢Adriano Aguzzi、Johan Bijzet、Bouke Hazenberg、Frank Heppner、Mathias Jucker、Therese Klingstedt、Karin Magnusson、Christina Sigurdson、Daniel Sjölander、Christoph Röcken、Gunilla Westermark、Per Westermark和Kurt Zatloukal为本出版物提供的组织切片或显微图像。本文所展示数据的收集工作得到了瑞典脑基金会（Hjärnfonden）、瑞典阿尔茨海默病协会（Alzheimerfonden）、瑞典研究理事会（VR）、Göran Gustafsson协会、Georg &amp;#38; Astrid Olsson基金会、欧盟FP7健康项目LUPAS以及林雪平大学的资助。

注意：LCO 的合成已在我们的实验室中进行了十余年。通过基本应用亲电芳香取代、钯催化交叉偶联、酰胺偶联和酯水解等反应方案，我们可针对不同用途对探针进行合成修饰5,12。合成完成后，经过表征与纯化，LCO 产物经冷冻干燥并室温保存。部分探针（其中包括 hFTAA）目前已可商业获取（见材料表）。
1. LCO染色液
注意：如果 hFTAA 是从商业供应商处购买的，请遵循供应商的说明，而非本文件的第 1 节。
<ol>
	<li>用 2 mM NaOH 重悬冻干的 hFTAA，配制浓度为 1 mg/mL 的储存液。将储存液置于玻璃小瓶中，于 4 °C 保存。储存液可保存一年。</li>
	<li>染色当天，用磷酸盐缓冲液（PBS）将储存液按 1:10,000 比例稀释，配制工作液。</li>
</ol>
2. 组织样本的制备
注意：可使用 hFTAA 作为淀粉样蛋白标记物对多种组织类型进行成像。示例见图1。hFTAA 对聚集体构象敏感，因此染色应优先在未破坏的聚集体上进行，避免表位暴露。若要获得最佳光谱质量，应尽量减少组织固定步骤。因此，首选在染色时用乙醇轻柔固定的冷冻新鲜组织。然而，即使使用e.g.福尔马林固定的组织，也可检测到淀粉样蛋白沉积物。hFTAA 通常在组织中渗透性良好。应根据预期的成像技术选择合适的样本厚度。
<ol>
	<li>若使用甲醛固定、石蜡包埋的切片，需在二甲苯中脱蜡过夜。将切片依次浸入99%乙醇、70%乙醇和dH₂O中。2O 和 PBS 中各 10 分钟。让组织切片在室温条件下干燥。 
	注意：二甲苯必须始终在化学通风橱中操作。二甲苯及其他有机溶剂有害健康。
	<ol>
		<li>室温下解冻冷冻切片。将组织切片置于10%福尔马林中固定过夜，随后依次浸入99%乙醇、70%乙醇和dH₂O中进行复水。2O 和 PBS 中各 10 分钟。让组织切片在室温条件下干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向组织切片上添加 hFTAA 工作液液滴（约 200 µL），以完全覆盖切片。液滴应依靠表面张力保持在原位。室温孵育 30 分钟进行染色。</li>
	<li>用移液器加入500 µL PBS洗去染色液，然后将玻片浸入PBS溶液中浸泡10分钟。在室温条件下让组织切片自然干燥。</li>
	<li>使用荧光封片剂封片。封片剂需静置过夜。 
	注意：hFTAA 染色可与其他染色方法联合使用，例如免疫荧光、细胞或细胞器特异性标记物 等等进行共染色时，先完成您所选择的完整染色方案，最后从步骤2.2开始加入hFTAA染色。参见 图2 例如，进行免疫荧光时，建议选择激发波长在640 nm或更高的二抗。在此波长范围内，hFTAA不吸收光，因此不会被激发，也不会产生荧光。这可确保hFTAA与抗体之间无荧光串色现象。</li>
</ol>
3. 显微镜观察
注意：使用配备长通滤光片的荧光显微镜。以下所有设置均用于生成图4中的图像。根据淀粉样蛋白类型和组织样本的不同，可能需要进行相应调整。尽管hFTAA与淀粉样蛋白结合后对漂白具有稳定性，但在未观察或成像时，建议关闭光源。
<ol>
	<li>HIS 
	注意：实验使用带有长通发射滤光片和HIS相机头的落射荧光显微镜进行（参见 材料表).
	<ol>
		<li>使用配备长通滤光片和高光谱相机的标准荧光显微镜。确保高光谱相机已校准。</li>
		<li>在软件中命名项目，选择 &#34;光谱图像&#34; 并开始采集数据。</li>
		<li>使用436-nm激发滤光片通过目镜选择目标对象，并将光路切换至相机。</li>
		<li>在病例数据管理器（CDM）中，选择样本类型为Spectral，标记样本，然后点击采集。采集窗口将打开。</li>
		<li>在采集窗口中 &#34;光谱成像&#34;，打开设置菜单，选择采集属性，将光谱范围设为460 - 700，速度质量设为最高速度，测量类型设为气体/激光/窄带滤光片。关闭对话框。</li>
		<li>在图像菜单中，选择“实时全图”。在图标栏中，关闭条纹。选择一个成像区域，使其峰值内存值低于 800 MB。设置曝光时间，使图像总亮度介于 1,000 至 3,000 之间。在图标栏中，点击彩色相机图标，开始采集。图像采集完成后，点击保存 &#34;获取光谱图像&#34; 对话框和 &#34;新细胞&#34; 在“案例数据管理器”对话框中。</li>
		<li>在CDM中，使用“开始分析”按钮打开采集的图像，数据处理窗口将随之打开。</li>
		<li>通过使用光谱显示对话框选择感兴趣区域（ROI），可以从图像的每个像素收集光谱信息。选择 &#34;定义&#34; 并从图像的相关区域选择感兴趣区域。</li>
		<li>使用 Lib 按钮将光谱数据保存为文本文件。保存的 .txt 文件可导入任意选定的分析软件中。.slb 文件可用于数据处理软件内的分析。整个图像的高光谱数据立方体也可导出为原始文件，作为 &#34;图层保存为 tif 格式&#34;，或作为 &#34;文本格式的图层&#34; 用于数据和图像分析的外部软件应用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦显微镜 
	注意：共聚焦显微镜配备可调谐激光器作为激发光源。进行所有荧光发射实验时，将激光强度设为0.2%（对应平均功率为3 µW），针孔设为1艾里单位，帧尺寸设为1,024像素 × 1,024像素，扫描速度设为7，扫描次数平均为16次，位深度设为8位（参见 材料表这些参数需要针对每台共聚焦系统、激光光源和样品类型进行单独调整。
	<ol>
		<li>使用氩离子激光器在488 nm激发，通过lambda模式采集发射光谱数据。在32通道GASP探测器的22个通道内，收集503至687 nm范围的发射光。增益设为755。</li>
		<li>为获得单通道图像，请使用智能设置选项。对于FITC（绿色滤光片），将增益设为750；对于Alexa 535（红色滤光片），将增益设为845。</li>
		<li>使用可调谐激光器采集激发光谱时，在490至545 nm范围内以1 nm步长进行激发，同时收集551至586 nm范围内的发射光。将激光强度设置为2%（对应平均功率为30 µW），增益设置为774。</li>
		<li>以光谱模式采集Z轴堆栈图像时，以0.96 µm为步长扫描组织切片的整个深度。可使用与步骤3.2.1相同的激发和发射设置，但增益设为730。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光寿命成像显微镜 
	注意：共聚焦显微镜配备有荧光寿命成像模块（FLIM）（参见 材料表).
	<ol>
		<li>设置共聚焦显微镜的以下参数：针孔大小为20，激发波长为490 nm，激光强度为0.5%（对应平均功率为7.5 µW）。使用重复频率为40 MHz的脉冲激光器。</li>
		<li>在 FLIM 软件中，设置对 550 nm 以上的光子进行计数。在显示参数窗口中，持续监测光子计数，直至最大计数值达到约 4,000 个光子计数。</li>
		<li>保存文件并将其导出为SPC图像。</li>
		<li>在FLIM软件中将数据拟合为双组分指数衰减。拟合结果应给出χ2 &#60; 2 较好。y 轴上的数值表示对应寿命的计数数量。</li>
		<li>选择包含计数的阈值， 例如，100。按T1着色并选择寿命范围。衰减依赖于hFTAA结合的淀粉样蛋白结构。已观察到300至1,000 ps之间的荧光寿命。保存文件。</li>
		<li>使用导出选项导出原始数据，并将所需数据保存到新文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+proteins+and+amyloidosis%3A+chemical+identification+and+clinical+classification+International+Society+of+Amyloidosis+2016+Nomenclature+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines.</a> Amyloid. 23, 209-213 (2016).</li>
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</ol>

PH、PN、MB 和 SN 是 Ebba Biotech 的小股东，该公司以商品名 Amytracker545 推广销售 hFTAA。

异常折叠蛋白质沉积形成淀粉样物质是多种疾病过程中的关键事件。阿尔茨海默病患者脑中可见由Aβ肽组成的细胞外淀粉样斑块以及由过度磷酸化tau蛋白形成的细胞内神经原纤维缠结。多种不同的蛋白质， 例如转甲状腺素蛋白（TTR）、血清淀粉样蛋白A组分（SAA）和IgG轻链发生错误折叠，并在中枢神经系统外的组织中形成淀粉样沉积。尽管淀粉样沉积已被认识和研究超过一个世纪，我们仍缺乏对其在分子水平上如何启动以及如何阻止这一过程的详细认知。对于阿尔茨海默病而言，必须阐明淀粉样变过程与神经退行性病变之间的关联。治疗淀粉样变性疾病的关键目标之一是开发新型、精确的工具，用于监测淀粉样变的起始、进展和消退；因此，靶向性淀粉样蛋白检测至关重要。从长远来看，临床诊断将受益于提高淀粉样染色方法的灵敏度和特异性。7,15当前在这一领域面临的挑战极为巨大，也是十分活跃的研究方向。临床开发与试验中的一个主要问题是预后诊断。这些疾病可能在症状出现之前很久就已经开始，但要启动治疗，必须首先明确疾病的识别。因此，灵敏度是新型方法学的关键要素。此外，这一问题更为复杂，因为某些蛋白质聚集体具有毒性，某些具有保护作用，而另一些则呈中性。因此，监测特定聚集形态的能力至关重要，因为已有研究提出，不同聚集物物种的存在可解释多种神经退行性蛋白聚集疾病中所报道的异质性表型。例如，朊病毒蛋白是同一氨基酸初级序列可错误折叠为不同聚集形态的经典范例，从而产生特异性的朊病毒株型。类似的多态性也在Aβ肽、α-突触核蛋白和tau蛋白中被报道。在这一方面，LCOs已被证明是光学识别不同聚集形态的杰出工具。由于LCOs产生的构象诱导光学现象，研究人员已成功区分了具有朊病毒株型特异性的蛋白质聚集体、多种系统性淀粉样变性中发现的蛋白沉积物，以及多态性的Aβ和tau聚集体。
淀粉样蛋白沉积是一种发生在难以用具有分子精度的生化或生物物理方法穿透的组织中的事件。利用相同的LCO分子在体外（ex vivo）、体内（in vivo）和体外（in vitro）探测该过程的可能性，为借助仅适用于体外（ex vivo）或体外（in vitro）样本的技术来揭示体内（in vivo）发生的事件奠定了基础11,17。最近报道的一个高分辨率结构模型显示，LCO五聚体FTAA（pFTAA）结合于由平行排列的侧链形成的空腔中，该空腔沿纤维轴方向跨越6条平行且对齐的β-链18，表明可以获得关于LCO靶标实体的原子级分辨率信息。本质上，pFTAA的结合空腔和结合模式与刚果红相似19，均由富含重复正电荷赖氨酸侧链的沟槽决定。LCO的亲和力似乎优于刚果红，这可能归因于其分子链的柔韧性以及噻吩环上的硫原子与疏水空腔之间强烈的范德华相互作用。对前纤维物种（在ThT产生响应之前）的检测5,20似乎依赖于由对齐平行β-链组成的重复性β-折叠结构；对于比pFTAA多两个噻吩单元的hFTAA而言，其跨越的β-链数量可达8条。
染色方案需注意以下步骤中的问题排查：（i）固定：组织样本过度固定可能破坏淀粉样蛋白结构，限制检测由hFTAA分子构象扭曲引起的荧光光谱变化的可能性。为获得最佳光谱分辨率，建议对新鲜冷冻材料的冷冻切片进行温和固定。然而，hFTAA仍可对固定组织中的淀粉样蛋白进行染色并产生荧光，但效率降低且光谱变化减少。（ii）抗原表位暴露：为实现抗体结合而对组织进行的预处理有时可能因淀粉样蛋白结构被破坏，导致hFTAA结合能力下降。若存在此问题，且抗原表位暴露是抗体染色方案中的关键步骤，则可考虑分别使用连续切片进行抗体和hFTAA染色。（iii）过度染色：hFTAA具有极高灵敏度，工作液浓度应保持在低nM水平。若背景染色严重，应降低hFTAA浓度。若组织中hFTAA结合成分稀少，过量hFTAA可能在封片介质中聚集并沉积，表现为不在组织焦平面内的荧光信号。若出现此情况，应将已封片的载玻片浸入PBS中，直至盖玻片可滑脱，随后用PBS洗涤，并使用新鲜封片剂和新的盖玻片重新封片。（iv）滤光片成像：本文主要描述使用长通滤光片或多通道检测进行的光谱分辨荧光成像。hFTAA也可通过短通滤光片进行检测，但需注意这将降低对比度，并消除检测多种颜色信号的可能性。
近年来，作为研究工具，荧光寡噻吩乙烯（LCO）尤其是hFTAA，已显示出极具前景的特性。已有研究结果表明，hFTAA可用于多种蛋白质及疾病状态的检测，包括细胞内聚集体（如tau蛋白、包涵体肌炎）、血清淀粉样蛋白A的系统性淀粉样蛋白、转甲状腺素蛋白、免疫球蛋白轻链（κ和λ）、精液凝固蛋白1、朊病毒蛋白（包括临床样本）21、胰岛淀粉样多肽以及胰岛素7,15。然而，hFTAA作为诊断工具应用的一个限制因素在于，荧光显微镜在常规淀粉样蛋白病理实验室中尚未广泛使用。此外，HIS在临床环境中也并不容易获得。不过，已有临床实验室采用基于滤光片的荧光显微镜进行hFTAA淀粉样蛋白染色和荧光显微成像，并应将其视为一种辅助性诊断方法。最近一项研究已在腕管综合征活检样本中，针对转甲状腺素蛋白淀粉样变性，采用自动化方式结合基础荧光设置成功实现了该方法的应用22。
此外，除了多种蛋白质外，hFTAA 荧光还能识别多种纤维类型及纤维前体淀粉样聚集体，例如，已检测并表征了不同途径中的纤维状物种。在本研究中，我们利用三种显微镜技术，在多种样品类型上展示了 LCO 的应用。通过可控合成方法，还推动了 LCO 在生物分子靶标多功能检测中的发展，例如，利用表面等离子体共振（SPR）23 记录分子相互作用，以及用于正电子发射断层扫描（PET）的放射性标记24。
迄今为止，已有超过25种不同的LCO被发表。LCO在淀粉样沉积物成像中的应用日益广泛，将增进我们对这些与疾病相关的聚集体如何组装、解聚以及干扰其所在器官和个体的机制的理解。

淀粉样物质在组织中的沉积是多种疾病的病理学特征，例如阿尔茨海默病、帕金森病、系统性淀粉样变性和朊病毒病。尽管淀粉样蛋白相关疾病十分常见，且迄今已有近40种不同的人类蛋白质被归类为淀粉样前体蛋白1，但关于淀粉样沉积与疾病表型之间的关系仍知之甚少。来自人类患者的样本组织学检查已被广泛用于诊断和科学研究。目前已建立大量动物模型，用于研究淀粉样负荷与行为、寿命以及其他多种疾病进展相关表型指标之间的相关性2,3。在药物发现与设计领域，人们也正投入大量努力以应对一些危害严重的广泛性疾病。然而，评估基因型、表型、淀粉样斑块负荷以及药物给药之间的关联并不简单。目前用于组织中淀粉样蛋白染色和成像的技术工具往往不够灵敏，所提供的关于淀粉样蛋白形成及其结构的信息分辨率较低。
刚果红双折射、硫黄素T（ThT）和硫黄素S（ThS）荧光是检测和分析患者活检组织、尸检样本以及疾病动物模型中淀粉样蛋白负荷的经典方法示例4。这些技术已使用数十年（刚果红自20世纪20年代起，ThT及其衍生物自20世纪60年代起），尽管仪器设备已得到改进并能够实现更精细的分析，但染色程序和分析方法仍几乎与一个世纪前相同。
在本文中，我们描述了一种高灵敏度新型淀粉样蛋白染料 hFTAA 的应用5，能够高精度地检测出微小的未成熟蛋白质沉积物，同时也能检测成熟的淀粉样蛋白。与传统染料相比，hFTAA 已被证实可检测更广泛的与疾病相关的蛋白质聚集体5,6,7此外，hFTAA 还可用于不同聚集形态类型的光学鉴定8本文描述了对朊病毒病的成熟动物模型以及旨在模拟阿尔茨海默病中斑块形成的淀粉样β前体蛋白（APP）转基因小鼠组织进行的hFTAA染色与分析。9,10我们还展示了对系统性淀粉样变性患者诊断样本和尸检样本的分析。LCO 具有内在特性，能够反映单个斑块内构象的差异；通过结合两种在结合特性和荧光特性上不同的 LCO，这种差异更加显著11使用配备长通滤光片和高光谱相机头的落射荧光显微镜，可实现对光谱特性的客观分类，并记录用于光谱分析的显微图像。采用可调谐激光器作为激发光源的共聚焦荧光显微镜，可用于更详细地评估淀粉样斑块的三维特性。可调谐激光器能够采集激发光谱，而显微镜上连续可调的发射波长选择功能则可实现LCO荧光与免疫荧光的共成像，从而确定目标蛋白与淀粉样物质的共定位情况。荧光寿命成像（FLIM）对LCO所受构象差异具有前所未有的灵敏度，能够揭示在荧光发射光谱上可能无法检测到的差异。
所述染色方法的主要目标是促进对微小淀粉样沉积物的高灵敏度检测，并表征淀粉样沉积物内部的构象多态性。这一知识对于理解蛋白质聚集性疾病的基础机制具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako 荧光封片介质</td><td>Agilent Technologies</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM6000</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Prior</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectraview 成像系统</td><td>ASI 光谱成像</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectraview 软件</td><td>ASI 光谱成像</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2010b v6.0 软件</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM 系统</td><td>Becker &amp; Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可调谐激光器 In Tune</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像技术对经发光共轭寡噻吩染色的淀粉样组织进行成像

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

在全身各组织中以淀粉样形式沉积的蛋白质可能是多种疾病的致病原因或结果。其中，包括主要影响中枢神经系统的神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病，以及系统性淀粉样变性病，后者表现为血清淀粉样蛋白A、转甲状腺素蛋白和IgG轻链在肝脏、腕管、脾脏、肾脏、心脏及其他外周组织中沉积为淀粉样物质。淀粉样物质已被认识和研究超过一个世纪，通常使用特异性染料如刚果红、硫黄素T（ThT）或硫黄素S（ThS）进行检测。本文中，我们以七聚甲酰基噻吩乙酸（hFTAA）为例，介绍一类新近开发的发光共轭寡聚噻吩（LCOs），作为上述染料的补充。hFTAA使用简便，可与免疫荧光染色或其他细胞标记物共染。大量研究表明，与传统淀粉样染料相比，hFTAA能够检测更广泛的一系列疾病相关蛋白聚集体。此外，hFTAA还可用于光学鉴定不同聚集形态类型，从而支持对淀粉样纤维多态性的研究。尽管成像方法可自行选择，本文展示了高光谱成像（HIS）、激光扫描共聚焦显微镜和荧光寿命成像（FLIM）。这些示例说明了LCOs可用作研究淀粉样蛋白形成过程及其结构特性的多种成像技术工具。该技术的一个重要局限性在于，与所有传统光学显微技术一样，要求聚集体具有显微尺度大小才能被检测。此外，聚集体必须包含重复的β-折叠结构，以利于hFTAA结合。过度固定和/或表位暴露若改变了聚集体的结构或构象，则可能导致hFTAA结合不良，从而限制成像的准确性。

对来自人类患者和实验动物多种组织类型中大量蛋白质形成的淀粉样沉积物进行灵敏且特异性的染色，对于临床诊断和科学研究都至关重要。本文中，我们展示了如何使用LCOs（以hFTAA为例）对多种组织类型的淀粉样物质进行染色和多模态成像。自十余年前首次发表基于噻吩的淀粉样配体以来13，研究人员已利用LCOs对多种组织中由不同蛋白质组成的淀粉样沉积物进行了成像6,7,11,14,15,16（图1）。LCOs与抗体或其他组织学标记物联合使用时，可为诊断和科研提供极为优秀的工具（图1a，图2）。通过合理选择荧光标记物，可在同一组织切片上同时成像多种荧光染料（图1a，hFTAA与DAPI；图2a，免疫荧光设置中的hFTAA）。此外，也可使用连续切片分别进行明场和荧光染色（图2b，hFTAA与DAB抗体染色）。最近的研究证明，hFTAA在临床诊断中可作为刚果红染色的一种极具前景的补充手段7,15（图3）。
近几十年来，成像技术的发展增加了对能够以定量方式区分淀粉样沉积物之间微小但显著差异的染料的需求。LCO 中的共轭体系赋予其独特的能力，可报告其结合模式的变化。分子的扭曲可能导致共轭体系中结合角度的形变，并阻碍电子的传输。图4a）。这反过来会影响LCO的荧光特性，包括激发和发射波长以及发射寿命。我们在配备长通发射滤光片的正置荧光显微镜中使用HIS。对于共聚焦显微镜和荧光寿命成像（FLIM）中的激发和发射光谱，我们使用配备脉冲激光器的LSM780系统。为了展示不同技术的应用，我们对同一个样本（即APP转基因小鼠中的β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块）进行了成像（图4b-e). 高光谱荧光光谱（图4b)可用于评估斑块不同区域内的光谱位移和强度变化。共聚焦显微镜中的激发光谱（图 4c可用于确定下游实验的最佳激发波长， 例如，多种荧光染料的联合染色。该方法还可用于检测LCO结合模式中的构象差异。在共聚焦模式下获取发射光谱，可用于确定hFTAA或多种荧光染料组合的荧光发射特性，以评估多种LCO之间或LCO与免疫荧光联合实验中的共定位情况。hFTAA的荧光寿命受其结合模式微小变化的显著影响，因此荧光寿命成像（FLIM）是区分结合靶标对hFTAA所产生差异的有力工具。图 4d可用于区分不同的朊病毒株8共聚焦成像及将Z轴层扫图像处理为三维图像，是研究淀粉样聚集体整体形态的有力工具（图 4e）。此外，使用其他荧光染料有助于了解沉积物的组成。
<img alt="显示样品荧光分析的显微镜图像，比例尺为20-100 µm，不同CR等级。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：不同组织类型及蛋白质聚集体的h-FTAA染色结果：(a) 肝脏中由角蛋白聚集体构成的Mallory-Denk小体（DAPI复染），(b) 散发性包涵体肌炎（s-IBM）肌肉组织中p62阳性包涵体，(c) 人胰腺中胰岛淀粉样多肽形成的淀粉样物质，(d) 人肠道中免疫球蛋白轻链形成的淀粉样物质，(e) 小鼠脑组织中的羊瘙痒病（朊病毒），(f) 小鼠脑组织中的慢性消耗性疾病（朊病毒），(g) APP23小鼠脑组织中的Aβ斑块，(h) APP/PS1小鼠脑组织中的Aβ病变，以及(i) 根据标准刚果红（CR）评分分级为1–4级的中国台湾患者转甲状腺素蛋白淀粉样变诊断样本脂肪活检涂片。黄色区域显示hFTAA染色的淀粉样沉积物，蓝色为脂肪组织自发荧光。各图中标尺长度已在对应图中注明。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示组织中蛋白质定位和结构的荧光显微镜图像，尺度为100µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2：抗体共染色示例。 （a）在同一组织切片上使用抗血清淀粉样蛋白A（AA）免疫荧光染色与hFTAA对人AA型淀粉样蛋白进行共染色。左上图：AA抗体发射波长640 nm；右上图：hFTAA在488 nm处的信号；下图：叠加图像，黄色显示共定位。 （b）在连续切片上分别进行抗体染色与hFTAA荧光染色。上图：AA抗体DAB染色；下图：使用长通发射滤光片成像的hFTAA。比例尺：100 µm。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="骨组织组织学比较示意图，突出显示显微图像中密度和结构的差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：比较使用短通滤光片时转甲状腺素蛋白淀粉样物质在人心脏组织上的荧光成像，组织染色分别为Mayer氏苏木精/刚果红（a-d）和Mayer氏苏木精/hFTAA（e）。（a）明场图像，（b）明场+荧光，（c）明场+交叉偏振器，（d）明场+荧光+交叉偏振器，（e）hFTAA在405 nm和480 nm激发下的荧光（与a-d为连续切片）。比例尺：100 µm。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="聚合物荧光；平面构象与扭曲构象；光谱分析示意图；光谱拟合结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用 hFTAA 染色并采用多种技术成像的同一对象，以一只老年 APP23 小鼠中的一个 Aβ 斑块为例进行展示。 （a）hFTAA 的荧光特性由其构象状态决定。图中显示了 hFTAA 在平面和扭曲状态下的结构。（b）高光谱成像用于评估连续发射光谱。下方面板中的光谱根据图像中标记的感兴趣区域以颜色编码。（c）（i）共聚焦成像用于激发成像，以及（ii 和 iii）在滤光模式或（iv）光谱模式下的光谱与发射成像。（d）荧光寿命成像用于检测淀粉样蛋白中构象差异，其中 Aβ 斑块的外围区域寿命较短，而中心区域的寿命较长。下方面板中的直方图显示了整个斑块的寿命分布情况。图像根据直方图下方的色阶进行着色。（e）在滤光模式下采集的共聚焦 Z 堆栈图像，用于展示对象的三维结构。每个面板中标注了比例尺长度。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

淀粉样蛋白沉积是多种疾病的特征，并可累及多个不同器官。本文介绍了荧光标记的共轭寡噻吩染色法结合荧光显微镜技术的应用。该染色方法在临床和科研环境中均为检测和研究蛋白质聚集体的有力工具。

在全身各组织中以淀粉样形式沉积的蛋白质可能是多种疾病的起因或结果。在这些疾病中，我们发现……

本方法的总体目标是在临床和科研环境中检测蛋白质聚集物沉积。文中描述了使用七甲酰基噻吩乙酸染色并分析朊病毒病和阿尔茨海默病动物模型组织的方法。该方法有助于回答淀粉样蛋白研究领域中的关键问题，例如微量蛋白质聚集物的存在及其内在构象差异。该技术的优势在于，与其他常规技术相比，具有更高的选择性和灵敏度。由于可针对所需的成像技术定制探针，该方法在多种蛋白质错误折叠疾病的治疗或诊断方面具有广泛的应用前景。通常，初学者在使用该方法时会遇到困难，原因是hFTAA所需的染色浓度极低。HFTAA 与传统染料相比还具有更长的激发波长和发射波长。通过将冻干的 hFTAA 重新悬浮于 2 毫摩尔的氢氧化钠中，配制浓度为 1 毫克/毫升的储备溶液。将储备溶液转移至玻璃小瓶中，并在 4 摄氏度下保存。若使用福尔马林固定、石蜡包埋的切片，需在二甲苯中脱蜡过夜。染色当天，将切片依次浸入99%乙醇、70%乙醇、dH2O和PBS中，每次十分钟。随后，让组织切片在常温条件下自然干燥。在组织干燥的同时，用 PBS 将 hFTAA 储存液按 1:10,000 的比例稀释，配制工作液。组织干燥后，将 hFTAA 工作液滴加至每张组织切片上，使其完全覆盖。室温孵育 30 分钟。用 500 微升 PBS 洗去染色液，然后将切片浸入 PBS 浴中 10 分钟。待切片在常温条件下自然干燥后，使用荧光封片剂封片。让封片剂过夜沉降。可以在封片后直接进行淀粉样蛋白检测，甚至无需封片即可进行。然而，如果实验目的是获取高质量的光谱信息，则建议过夜孵育。打开显微镜软件，命名项目，选择光谱图像模式，然后开始采集。使用436纳米激发滤光片通过目镜选择目标物体，并将光路切换至相机。在案例数据管理器中，选择样本类型为光谱型，标记样本，然后点击“采集”。采集窗口将打开。在光谱成像下，打开设置菜单，选择采集属性，将光谱范围设置为 460 至 700，速度质量设为最高速度，测量类型设为气体激光窄滤光片。关闭对话框。在图像菜单中，选择实时全视野。在图标栏中关闭条纹。选择一个成像区域，并确保峰值内存值低于 800 兆字节。设置曝光时间，使总图像亮度在 1,000 到 3,000 之间。在图标栏中，按下彩色相机按钮。采集将开始。当图像采集完成后，在“获取光谱图像”对话框中按下保存，并在“病例数据管理器”对话框中选择新建细胞。在病例数据管理器中，点击“开始分析”按钮以打开采集的图像，此时将打开数据分析窗口。通过使用光谱显示对话框选择感兴趣区域（ROI），可从图像的每个像素收集光谱信息。选择并定义图像相关区域的感兴趣区域（ROI）。使用 Lib 按钮将光谱数据保存为文本文件。保存的 txt 文件可导入至任意选定的分析软件中。打开显微镜软件，开始设置共聚焦显微镜。将激光强度设为0.2%，针孔设为一个艾里单位，帧尺寸设为1,024 × 1,024像素，扫描速度设为7，对16次扫描进行平均，位深度设为8位。为采集发射光谱，选择lambda模式，并将氩离子激光器设为488纳米。使用32通道gasp探测器中的22个通道收集499至691纳米范围内的发射光。将增益设为755。点击实时按钮，将调色板更改为范围指示器，并调节增益，使红色区域像素不出现过载。单击停止按钮，然后通过拍摄按钮捕获图像。为获得单通道图像，请选择智能设置选项，然后选择 FITC 和 Alexa 532。选择线性解混并应用。调节增益以确保像素不超载。在实时模式下，FITC 的增益设置为 693，Alexa 532 的增益设置为 433。单击停止按钮，然后通过快照按钮捕获图像。将显微镜切换至FLIM模式。将针孔设为20，激发波长设为490纳米，激光强度设为0.5%，使用40兆赫的脉冲激光。在 FLIM 软件中，设置对 550 纳米以上的光子进行计数。在显示参数窗口中，持续监测光子计数，直至最大计数达到约 4,000 个光子计数。保存文件并将其导出为 SPC 图像。该图像显示了经DAPI复染的肝细胞中由角蛋白聚集物组成的Mallory-Denk小体。此处显示的是散发性包涵体肌炎骨骼肌组织中P62阳性的包涵体。该图像显示了人胰腺中胰岛淀粉样多肽的淀粉样包涵体。图中显示了人类肠道中免疫球蛋白轻链的淀粉样沉积。该图像展示了绵羊瘙痒病的朊病毒蛋白聚集体在小鼠脑中的沉积。此处显示的是感染慢性消耗性疾病的小鼠脑中朊病毒蛋白的聚集体。此图像显示了 APP23 小鼠脑中的 Aβ-淀粉样蛋白斑块。此图像显示了 APP-PS1 小鼠脑中的 Aβ 病理变化。这些脂肪活检涂片来自人类患者转甲状腺素蛋白淀粉样变性的诊断样本，根据标准刚果红染色评分分为 1 至 4 级。黄色区域显示的是 hFTAA 染色的转甲状腺素蛋白淀粉样沉积物，蓝色为脂肪组织的自发荧光。进行该操作时，需注意使用足够低的染色浓度。同时应使用长通滤光片，以获得最大对比度，并避免自发荧光和背景染色荧光的干扰。完成此操作后，可进一步采用免疫荧光等其他方法，以鉴定聚集的蛋白质以及共聚集的蛋白质。该技术建立后，为淀粉样变性领域的研究人员探索蛋白质聚集体结构，以及有机化学领域设计针对这些靶点的新型探针奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何进行LCO染色，并结合不同成像技术进行观察。

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