用高光谱共聚焦显微镜和荧光寿命成像对发光共轭吩染色的淀粉样组织的成像

该方法的总体目标是在临床和科学设置中检测蛋白质聚集体沉积物。描述了庚啶甲酰噻吩乙酸染色和朊病毒病和阿尔茨海默病动物模型的组织分析。这种方法可以帮助回答淀粉样蛋白领域中的关键问题，例如少量蛋白质聚集体的存在及其内在构象变异。

这种技术的优点是它比其他传统技术更具选择性和更敏感。该技术的意义延伸到各种蛋白质错误折叠疾病的治疗或诊断，因为有可能为所需的可视化技术定制探针。通常，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为 hFTAA 需要如此低的染色浓度。

与传统染料相比，HFTAA 还显示出更长的激发和发射波长。通过将冻干的 hFTAA 重悬于两毫摩尔氢氧化钠中来制备发光共轭寡噻吩溶液，以制备每毫升 1 毫克的储备液。将储备溶液转移到玻璃瓶中，并在 4 摄氏度下储存。

如果使用福尔马林固定、石蜡包埋的切片，则在二甲苯中脱蜡过夜。染色当天，将切片浸入 99% 乙醇、70% 乙醇、dH 2 O 和 PBS 的连续浴中，每次 10 分钟。然后，让组织切片在环境条件下干燥。

当组织干燥时，通过在 PBS 中将原液稀释 1 至 10， 000 来制备 hFTAA 的工作溶液。当组织干燥时，将 hFTAA 工作溶液的液滴添加到每个组织切片中以覆盖它。在室温下孵育 30 分钟。

用 500 μL PBS 冲洗染色溶液，然后将玻片浸入 PBS 浴中 10 分钟。让切片在环境条件下干燥后，使用荧光封片剂进行封片。让封固剂沉淀过夜。

淀粉样蛋白检测可以在封片后直接进行，甚至可以不封片。但是，如果实验的目标是收集高质量的光谱信息，则首选过夜孵育。打开显微镜软件，为项目命名，选择光谱图像，然后开始采集。

使用 436 纳米激发滤光片通过目镜选择感兴趣的物体，并将光路转移到相机。在案例数据管理器中，选择样品类型谱图，标记样品，然后按 acquire。将打开客户获取窗口。

在光谱成像下，打开设置菜单，选择采集属性，并将光谱范围设置为 460 至 700，将速度质量设置为最大速度，并将测量类型设置为气体激光窄滤光片。关闭对话框。在图像菜单中，选择 live full。

在图标栏中，关闭边缘。选择要成像的区域，并确保峰值内存值低于 800 MB。将曝光时间设置为一个值，该值提供介于 1， 000 和 3， 000 之间的总图像亮度。

在图标栏中，按彩色相机。收购将开始。图像采集完成后，在 acquire spectral image （采集光谱图像） 对话框中按 save（保存），在 case data manager （案例数据管理器） 对话框中按 new cell（新建单元格）。

在案例数据管理器中，使用 Start analysis 按钮打开收集的图像。此时将打开数据分析窗口。通过使用光谱显示对话框选择 ROI，可以从图像的每个像素收集光谱信息。

选择定义并从图像的相关区域中选择 ROI。使用 Lib 按钮将光谱数据保存为文本文件。保存的 txt 文件可以导入到任何选择的分析软件中。

打开显微镜软件，首先设置共聚焦显微镜。将激光强度设置为 0.2%针孔到 1 个艾里单位，帧大小为 1， 024 x 1， 024 像素，扫描速度为 7 次扫描平均 16 次扫描，位深度为 8 位。要收集发射光谱，请选择 lambda 模式并将氩激光器设置为 488 纳米。

使用 32 通道 gasp 检测器中的 22 个通道收集 499 到 691 纳米之间的发射。将增益设置为 755。单击实时按钮，将调色板更改为范围指示器，并调整增益以允许红色的非过载像素。

单击停止按钮，然后通过捕捉按钮捕获图像。要获得单通道图像，请选择 smart setup 选项。选择 FITC 和 Alexa 532。

选择 linear unmixing 并 apply。调整增益以允许非过载像素。对于 FITC，在实时模式下将增益设置为 693，对于 Alexa 532，将增益设置为 433。

单击停止按钮，然后通过捕捉按钮捕获图像。将显微镜切换到 FLIM 模式。将针孔设置为 20，激发波长为 490 纳米，激光强度为 0.5%使用 40 兆赫兹的脉冲激光器。

在 FLIM 软件中，设置超过 550 纳米的光子计数。在显示参数窗口中，按照光子计数进行，直到最大计数约为 4， 000 个光子计数。保存文件并将其导出为 SPC 映像。

该图像显示了由 DAPI 复染的肝细胞中的角蛋白聚集体组成的 Mallory-Denk 小体。在这里，P62 阳性包含物显示在散发的包涵体肌炎骨骼肌组织中。该图像显示了人胰腺中胰岛淀粉样蛋白多肽的淀粉样蛋白包涵。

此处显示了免疫球蛋白轻链在人体肠道中的淀粉样蛋白沉积。这张图片显示了羊痒病在小鼠大脑中的朊病毒蛋白聚集体的沉积。这里显示了感染慢性消耗性疾病的小鼠大脑中的朊病毒蛋白聚集体。

该图显示了 APP23 小鼠大脑中的 A-β-淀粉样蛋白斑块。这张图片显示了 APP-PS1 小鼠大脑中的 A-β 病理。这些脂肪活检涂片来自人类患者的转甲状腺素蛋白淀粉样蛋白诊断样本，根据标准 Congo Red 评分分为 1 至 4 级。

黄色区域显示 hFTAA 染色的转甲状腺素蛋白淀粉样蛋白沉积物，蓝色区域表示脂肪组织的自发荧光。在尝试此程序时，请务必记住以足够低的浓度染色。还要记住使用长通滤光片以获得最大的对比度，并避免自发荧光和背景染色荧光。

按照此程序，可以执行其他方法，如免疫荧光，以识别聚集的蛋白质和识别共聚集的蛋白质。开发后，这项技术为淀粉样变性领域的研究人员探索蛋白质聚集体结构铺平了道路，并为有机化学为这些靶标设计了新型探针。观看此视频后，您应该对如何使用不同技术进行 LCO 染色和成像有一个很好的了解。