使用荧光寿命成像在老化C.Elegans中淀粉样蛋白结构的表征
2020年3月27日
荧光寿命成像监测器，定量和区分蛋白质在生活、衰老和压力的C.elegans疾病模型中的聚集趋势。
该方法使我们能够清楚地区分集成淀粉样蛋白结构与可溶性甚至累积的对应物。该技术以非侵入性的方式在体内进行，几乎没有毒性副作用。因为它取决于荧光素本身的荧光特性，因此随着时间的推移，它是高度健壮和可重复的。
FLIM已用于癌症诊断领域。然而，我们利用它来研究蛋白质聚集的基本机制，这些机制确实与神经退行性疾病有关。该方法可用于蛋白质聚集领域。
只要与疾病相关的蛋白质被标记在荧光探针上，就可以跟踪和监测它。可以成功研究促进或防止聚合的化合物和策略。任何允许通过光显微镜可视化的生物系统都适合在体内或外体内进行 FLIM，例如在细胞培养、固定或渗透样品以及任何必要的介质中。
在获取实验数据之前，请确保在线虫中测试所选荧光团的特性，并在获取测量结果之前测试该设置是否完全正常运行。首先，在NGM板块上生长并保持20摄氏度的线虫。将线虫年龄但直到第四天，作为年轻人，将第八天作为老年人。
在成像当天，从准备成像幻灯片开始。将加糖和双蒸馏水按体积的浓度为3%的重量放置。将其转移到微波炉中融化，然后稍微冷却。
切开一毫升移液器尖端，并服用大约200微升融化的阿加罗斯。将气糖放在干净的玻璃滑梯上，并立即将第二个放在顶部，避免形成任何气泡。让滑梯保持干燥，轻轻取下顶部玻璃滑梯。
其结果是一个玻璃幻灯片与均匀的红玫瑰表面，线虫将放置。一旦成像设置准备就绪，在立体显微镜下工作，将10微升的麻醉化合物滴到阿加罗斯垫上，轻轻将5至10个线虫转移到其中。使用睫毛尖端分离线虫。
将它们靠近，但不得接触，以便于在图像采集过程中更容易定位线虫。小心地用盖玻片覆盖线虫。安装后一小时内，进行测量。
确保线虫完全不动。打开 FLIM 采集软件。找到卡舌按钮，然后按启用输出。
将幻灯片与安装的 C.elegans 放在舞台上，并在传输模式下使用 10 倍放大镜，定位幻灯片上线虫的位置。取下幻灯片，将目标切换到 63 倍放大镜头，然后应用所需的浸入介质。将幻灯片放在舞台上并本地化线虫。
开始扫描样品。选择感兴趣的区域并专注于其最大投影平面。在 FLIM 软件的界面上，预览检测到的光子数量。
ADC 值应介于 1 倍 10 到 4 之间，1 倍 10 到 5 之间。如有必要，将焦点转移到不同的平面上或增加激光功率以收集更多的光子。确保避免光子堆积，但收集足够数量的光子，以创造良好的寿命拟合和测量。
在菜单栏中，选择选项卡以设置采集参数。选择扫描同步以允许单光子检测。将采集设置为固定时间量或固定数量的光子。
按开始开始采集。打开软件，通过文件导入FLIM数据文件，加载FLIM数据。加载所有样品从一个条件，即使在不同的会话和不同的生物重复获得。
如有必要，通过分段、分段管理器对许多 FLIM 图片进行分段信号线虫。将裁剪工具拖动到感兴趣区域周围，直到突出显示。完成后，按"确定"。选择显示 C.elegans 强度的图像的小区域。
该区域衰减曲线出现在界面右侧的大衰减窗口中。要推断生存期，在数据选项卡上设置 40 到 300 之间的任意集成最小值，以排除任何太暗的像素，无法产生良好的拟合。选择最短时间和最大时间数，以将 FLIM 信号限制为这些值。
不要更改一个的预设计数光子。输入采集过程中用的激光的兆赫的重复率。输入栅极最大值以排除所有饱和像素。
在生存期选项卡上，选择要使用的全局拟合。如果已知所选荧光衰减是多指数且显示超过单个生存期，则除指数选择数外，不要更改任何其他参数。通过 IRF 菜单上传 IRF。
要估计 IRF 移位，请选择 IRF，估计 IRF 移位。一组值会自动显示在 IRF 选项卡上。建立此选项后，不要更改此选项卡的任何其他参数。
设置所有参数后，按拟合数据集。在蓝线中突出显示的结果拟合应与所有事件重叠。当所有事件都沿拟合对齐时，将获得良好的拟合。
单击软件界面右上菜单中的参数选项卡，选择统计、加权均值，并检查 chi 平方值是否尽可能接近一个。因此，所选图像的生命周期值将揭示为 tau 一。通过文件、导出强度图像、拟合结果表、图像、直方图导出任何感兴趣的信息。
在生命的第四天或第八天，C.elegans 表示肌肉 Q40 RFP 的代表地图显示在这里。IQ85 的较长 Q 延伸更易聚合，并且在直方图中表现出荧光寿命变化，这已经在生命的第 4 天。事实上，在第四天，在IQ44中观察到IQ85的后分形成。
然而，在老化时，IQ44也表现出烟叶形成，从而缩短了荧光寿命。最后，在NQ40CFP菌株中，未检测到烟叶形成，荧光寿命也降低。对于这种菌株，衰老时平均荧光寿命只有细微的非显著变化。
一旦建立了线虫模型，收集的光子数量对于获得良好的寿命拟合至关重要。该方法可进一步与不同的技术相结合，如福斯特共振能量转移、FRET、光漂白后荧光恢复、FRAP 或测量。所有这些适应提供了有关蛋白质研究及其聚合形式特性的额外信息。
在蛋白质聚集和蛋白质平衡领域，该技术允许调查对系统施加的任何扰动、不同蛋白质物种的分布以及贩运，以及一般来说，生物体内可溶性蛋白和不溶性蛋白质分数的差异和意义。麻醉钠酸中毒，应用手套和护目镜处理，并在烟罩下稀释。由于该技术是基于显微镜的，因此遵循与激光工作相关的所有警告非常重要。
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概述
本研究利用荧光寿命成像（FLIM）来监测和量化活体秀丽隐杆蚋模型中的蛋白质聚集。该技术允许对与神经退行性疾病相关的蛋白质结构进行非侵入性观察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 细胞生物学
背景
- 蛋白质聚集是神经退行性疾病的关键特征。
- FLIM提供了一种区分不同蛋白质状态的方法。
- 该技术在体内进行，具有最小的毒性。
- FLIM的应用不仅限于神经科学，还包括癌症诊断。
研究目的
- 调查蛋白质聚集的机制。
- 区分整合的淀粉样蛋白结构和可溶性蛋白质。
- 在秀丽隐杆蚋模型中应用FLIM研究衰老和压力的情况。
使用的方法
- 荧光寿命成像（FLIM）
- 秀丽隐杆蚋的体内成像
- 非侵入性观察技术
- 蛋白质聚集动态分析
主要结果
- 成功区分淀粉样蛋白结构与可溶性对应物。
- 展示了FLIM随时间推移的稳健性和可重复性。
- 强调了蛋白质聚集与神经退行性疾病的相关性。
- 显示该成像技术的毒副作用最小。
结论
- FLIM是研究活体中蛋白质聚集的有价值工具。
- 该方法可以增进对神经退行性疾病机制的理解。
- 未来的应用可能扩展到其他领域，包括癌症研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Fluorescence lifetime imaging (FLIM) enables noninvasive, quantitative monitoring of amyloid fibrilization in living models, supporting target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease programs. By distinguishing integrated amyloid structures from soluble species without staining, FLIM provides predictive confidence in early discovery workflows. The method’s robustness and reproducibility facilitate cross-functional collaboration and scalable assay development for protein homeostasis research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by distinguishing amyloid fibrils from soluble and accumulated protein species in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative, fluorescence-lifetime-based readouts that correlate directly with aggregation levels.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by allowing comparison of fibrilization across genetic backgrounds, environmental stimuli, or amyloid variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by enabling label-free, longitudinal tracking of protein aggregation in specific cells such as neurons.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through FLIM’s independence from fluorophore expression levels and resistance to photobleaching.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by detecting aggregation-promoting or -preventing strategies in any light-microscopy-compatible biological system.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by monitoring aggregation dynamics across aging and proteostasis network perturbations in disease-relevant models.
- Risk-Adjusted Decisions: Supports advancement decisions by quantifying soluble versus insoluble protein fractions in living organisms over time.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value when studying protein homeostasis, enabling comparison of trafficking and distribution of protein species without further staining.
Pipeline & Workflow Integration
FLIM integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical studies by providing quantitative, noninvasive readouts of protein aggregation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling visualization of amyloid structures in specific cells such as neurons during aging.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through photon collection and lifetime fitting that exclude dim pixels and saturated signals for robust measurements.
- Analytics: Provides statistical outputs such as chi-square values near one and weighted mean lifetime (tau one) to compare conditions and assess fit quality.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling observation of aggregation in aging models and upon proteostasis network perturbation, relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for comparing fibrilization across different amyloid proteins, genetic backgrounds, or environmental stimuli in vivo.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in protein aggregation studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of amyloid detection in vivo without staining or bleaching.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of aggregation propensity.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, longitudinal aggregation data in disease-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence lifetime imaging and laser safety protocols.
- Needs FLIM-capable microscopy setup with appropriate objectives (e.g., 63X immersion) and photon detection capabilities.
- Demands cross-team standardization of acquisition parameters such as scan sync, repetition rate, gate max, and photon collection thresholds (10⁴–10⁵ ADC).
- Involves adaptation considerations across model systems, including agarose pad preparation, anesthetic use (e.g., sodium azide), and immobilization protocols.
- Includes practical limitations such as the need to pre-test fluorophore properties in the nematode model and avoid photon pileup during acquisition.
