荧光显微镜下福尔马林固定人脑组织背景荧光的简单消除
2017年9月3日
生物样品的背景自发荧光常常使荧光成像技术复杂化, 特别是在老年人类 postmitotic 组织中。本协议描述了如何有效地去除这些样品的自体荧光, 利用商业上可用的发光二极管光源在免疫之前 photobleach 样品。
免疫荧光显微镜检查中的一个常见问题是存在内源性背景荧光，这可能会干扰您的信号。在许多情况下，这种自发荧光会使您的结果无法解释。在该协议中，我们将演示如何使用商用 LED 台灯的光漂白从人脑组织样品中去除自发荧光。
这种方法的主要优点是与当前技术相比，在不牺牲有效性的情况下显著节省成本，并且没有外源性化合物引入样品中。开始之前，请准备 1 次 tris 缓冲盐水、TBS 和 10% 叠氮化钠的储备液。对于您想要处理的每三个标准尺寸的显微镜载玻片，您将需要一个 100 毫米 x 100 毫米见方的培养皿作为载玻片室。
对于每个载玻片室，通过将 25 毫升 10% 叠氮化钠添加到 50 毫升 1 倍 TBS 中，在 TBS 中制备 50 毫升 05% 叠氮化物。创建一个支架来抬高您的载玻片室，以便灯头可以安装在下方。对于 100 毫米见方的培养皿，可以将类似尺寸的塑料食品容器切割成形状。
可以使用任何可以安全地升高载玻片室而不妨碍光线到达样品的部件。购买一盏白色荧光粉 LED 台灯，并移除覆盖光源的任何漫射器或不透明塑料。将 LED 阵列向上定向。
为此，建议使用具有灵活颈部的灯。通过照亮足够大的盒子内部以用铝箔覆盖载玻片室和脚手架，为设备构建一个反射圆顶盖。对于单腔室，可以使用 1 毫米移液器吸头盒。
在本视频中，福尔马林固定的人 FTLD-T 眼眶额叶脑组织进行了光漂白预处理。组织制备和氨基染色程序可能因组织切片的来源、固定和包埋而异。在 4 摄氏度的冷藏室、冷藏柜或冰箱中，将灯放在脚手架下方，将样品室放在脚手架顶部。
用 50 毫升叠氮化物 TBS 填充样品室。使用干净的镊子将安装在标准玻璃显微镜载玻片上的 10 微米厚的组织切片浸入样品室中。用反光圆顶盖住设备并打开 LED 灯。
让样品光漂白 48 小时。该孵育时间可能会有所不同，具体取决于灯的强度和组织中自发荧光物质的量。光漂白预处理后，可以使用针对特定组织和目标蛋白质的标准方案对载玻片进行免疫染色。
出于演示目的，使用与 Alexa 488 和 Texas Red 偶联的二抗对 FTLD-T 脑组织进行磷酸化 tau 染色。DAPI 用作核复染剂。制备 500 毫升抗原修复缓冲液、500 毫升 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液、10 毫升 1% 牛血清白蛋白、BSA 的 TBS 溶液和 2 毫升封闭溶液，由添加到 BSA TBS 中的山羊血清组成。
通过将光漂白玻片浸入玻片收集器中的抗原修复缓冲液中来进行抗原修复。将收集器在 90 摄氏度下加热 30 分钟。从热处理中取出除尘器后，重要的是让腔室在室温下冷却 30 分钟。
立即移除载玻片会导致切片变干。根据制造商的建议制备您的一抗混合物。在这种情况下，将抗磷酸化 PHF tau 对丝氨酸 202 加苏氨酸 205 AT8 抗体用 BSA TBS 以 1：100 的比例稀释并置于冰上。
每个切片需要 150 μL 抗体混合物。切片冷却 30 分钟后，将玻片从抗原修复收集器转移到装满 TBS Triton 的染色罐中。在此溶液中洗涤玻片 5 分钟，轻轻摇动。
清空并更换 TBS Triton，再次重复此洗涤步骤。洗涤后，从染色瓶中取出载玻片并吸走多余的缓冲液。使用疏水笔，在组织周围画出轮廓。
这将防止您的解决方案从幻灯片中跑出来。注意不要让载玻片变干。通过将 200 微升封闭溶液移液到载玻片上并将它们放入加湿室中来封闭组织。
这个腔室可以是简单的，就像移液器吸头盒内的载玻片架一样，里面有一条湿纸巾。确保整个组织样品都被封闭溶液覆盖。在室温下孵育 2 小时。
通过吸液器或移液管去除堵塞的溶液。将 100 至 150 μL 一抗混合物移液到载玻片上。确保整个样品都被抗体溶液覆盖，并且切片保持在水平表面上，以避免抗体不均匀混合。
在 4 摄氏度下与一抗在加湿室中孵育过夜。第二天，制备二抗混合物。在这种情况下，使用 BSA TBS 将山羊抗小鼠 Alexa 488 和山羊抗小鼠 Texas Red 稀释 1：100。
取回组织切片，并通过抽吸器或移液管去除一抗溶液。使用装满 TBS Triton 的染色罐，以与之前类似的方式洗涤载玻片两次，每次洗涤 5 分钟。洗涤后，吸走多余的缓冲液。
移液 100 至 150 μL 二抗溶液，再次确保组织样品完全覆盖。在室温下在加湿室中避光孵育 2 小时。根据制造商的建议或连续稀释，在 TBS 中制备 0.1 μg/ml DAPI 复染剂。
由于可能不溶，请务必充分混合 DAPI 储备液。取回载玻片并去除二抗混合物。洗涤样品两次，但不使用 TBS Triton，而是使用普通 TBS。
吸出或移出剩余的洗涤液，然后将 100 至 150 μL DAPI 染色剂移液到组织切片上。在室温下避光孵育 10 分钟。取回样品并用普通 TBS 洗涤 3 次，而不是 2 次。
洗涤后，小心去除剩余的洗涤液。涂抹封固剂。用玻璃盖玻片盖住样品，完成载玻片安装。
通过将盖玻片的一个边缘放下并使用镊子非常缓慢地降低对面的边缘来避免气泡。让封固剂干燥，然后在 4 摄氏度下避光储存。幻灯片现在可以进行可视化了。
荧光显微镜的设置将根据用于染色的荧光基团和显微镜而有所不同。打开荧光灯、显微镜和计算机，让荧光灯预热 15 分钟。将染色的组织载玻片放入荧光显微镜中。
使用明场以 10 倍放大倍率定位组织。找到合适的组织区域后，在样品的盖玻片上加入一滴水。切换到 20 倍水浸镜头。
在单独的轨道中选择适合每个荧光基团的激光激发和发射波长，以获得最佳信号。有关所用设置和波长的更多详细信息，请参阅随附的手稿。调整激光功率和增益设置以优化每个轨道的信号强度。
找到适当的设置和视野后，保存包含每个轨迹的荧光数据的合成图像。为了可视化每个通道中的荧光强度，请安装 ImageJ 的 RGB Profile Tools 宏。在 ImageJ 中打开 lsm 共聚焦图像文件，然后通过转到图像、颜色、通道工具将三个堆栈中的合成图像转换为 RGB。
选择 Composite 并选中所有三个通道。接下来，前往 图像， 类型及 RGB 颜色.选择 RGB Profile Tools 图标，并在图像中要分析的部分上画一条线。
在本视频中，描述了对组织样品进行光漂白预处理以产生背景荧光的步骤。在抗原修复和氨基染色之前，该程序可以添加到任何标准氨基荧光方案中。用于光漂白的装置价格低廉且易于获得，由现成的组件组成。
白色荧光粉 LED 发射的光范围很广，这使其非常适合大范围的光漂白。使用现成的 LED 台灯，对未染色的人类 FTLD-T 脑组织样品进行光漂白，并使用适当的波长进行成像，如果这些样品用 Texas Red 和 Alexa 488 染色，则这些波长是合适的。未处理的样品显示出大量的自发荧光。
相比之下，光漂白导致类似于脂褐素的自发荧光斑点的强度显著降低，以及一般的背景荧光。为了进一步验证这项技术，FTLD-T 脑组织样本对过度磷酸化的 tau 进行染色，tau 是一种在这种疾病中错误折叠并积累为不同包涵体的蛋白质。应用两种不同的二抗以更好地区分 tau 标记和非特异性荧光。
在这些合成图像中，Alexa 488 和 Texas Red 的共定位显示为黄色，代表正确染色的 tau 蛋白。红色或绿色区域的出现表明非特异性荧光或其中一个发色团的淬灭。在未处理的对照样品中，可以看到显著的背景和非特异性信号，尤其是在 Texas Red 通道中。
光漂白预处理以及化学淬灭剂的应用都会导致背景信号大大降低。如果我们拆分荧光通道并在更高的放大倍率下查看图像，则可以进行更详细的观察。未处理的对照在所有通道中都具有背景荧光，以及非特异性特征，主要在 Texas Red 通道中，其强度与 tau 特异性标记相似。
如果 tau 包涵体没有独特、可预测的形态，则由于存在这些自发荧光特征，这些 Texas Red 结果可能会被误解。光漂白预处理完全消除了这些 Texas Red 非特异性特征，同时保留了大部分 tau 特异性 Texas Red 和 Alexa 488 信号。然而，光漂白似乎对 DAPI 背景荧光几乎没有影响。
化学淬灭剂降低 Alexa 488 通道中的背景荧光与光漂白一样有效。然而，它也降低了 DAPI 和 Texas Red 的荧光强度，表明存在一些适得其反的淬灭。这些影响的量化可以在信号曲线中看到。
如您所见，此方法可生成没有混淆特征的干净图像。这种光漂白预处理可以整合到任何标准氨基荧光方案中，以去除自发荧光并产生高质量、明确的结果。
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概述
该协议解决了免疫荧光显微镜中背景自发荧光的挑战，特别是在老化的人脑组织中。它展示了一种使用商用LED光源进行光漂白以去除自发荧光的有效方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫荧光显微镜
- 荧光成像技术
背景
- 背景自发荧光可能会遮蔽荧光成像的结果。
- 这个问题在有丝分裂后的组织中尤为普遍。
- 目前减少自发荧光的方法可能代价高昂，并可能引入外源性化合物。
- 有效去除自发荧光对于准确解释结果至关重要。
研究目的
- 提供一种去除自发荧光的成本效益高的方法。
- 展示使用商用LED台灯进行光漂白的方法。
- 避免向生物样本引入外源性化合物。
使用的方法
- 制备三羧基乙酸缓冲盐水和叠氮化钠的原液。
- 使用商用LED台灯进行光漂白。
- 在显微镜载玻片上处理人脑组织样本。
- 实施载玻片孵育室以进行有效处理。
主要结果
- 处理后样本中自发荧光显著减少。
- 免疫荧光结果的清晰度和可解释性得到改善。
- 与传统方法相比节省了成本。
- 未引入外源性化合物，保持了样本完整性。
结论
- 该协议有效地去除了生物样本中的自发荧光。
- 使用LED光进行光漂白是一种比更昂贵技术更可行的替代方案。
- 这种方法提高了神经科学研究中的荧光成像质量。
常见问题
Executive Industry Relevance
Background autofluorescence in formalin-fixed human brain tissue presents a significant barrier to reliable immunofluorescence microscopy, impacting the accuracy of protein localization studies in discovery research. The described photobleaching protocol using white phosphor LED arrays enables high-fidelity imaging by eliminating confounding signals without compromising probe intensity. This accessible, cost-effective method supports robust target validation and enhances predictive confidence at critical early discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables unambiguous visualization of protein localization for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating autofluorescent artifacts in tissue imaging.
- Supports predictive confidence in hypothesis-driven studies of disease-relevant brain tissue.
- Facilitates portfolio triage by improving data quality for early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Prepares validated tissue samples with minimal background for downstream immunofluorescence assays.
- Improves assay reproducibility and standardization by removing variable autofluorescence.
- Enables quantitative, high-contrast imaging outputs for reliable compound or biomarker evaluation.
- Supports scalable, platform-agnostic workflows using off-the-shelf photobleaching components.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling clear imaging in postmitotic tissues prone to lipofuscin accumulation.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation by preserving probe signal integrity.
- Reduces risk of misinterpretation in biomarker or pathology studies involving human brain tissue.
Pipeline & Workflow Integration
This photobleaching protocol integrates seamlessly into the immunofluorescence workflow, from early discovery through preclinical research, by providing a standardized pre-treatment step for tissue samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling artifact-free imaging of protein localization.
- Screening: Delivers assay-ready samples with reproducible, low-background fluorescence for quantitative analysis.
- Analytics: Facilitates accurate measurement of probe-specific signals and statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Ensures continuity in biomarker studies by preserving signal specificity in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, low-cost capability for diverse tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in imaging-based studies.
- Operational Value: Standardizes sample preparation, enhances reproducibility, and is easily scalable with common laboratory equipment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing false positives and ambiguous results.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires basic expertise in immunofluorescence microscopy and tissue handling.
- Needs access to white phosphor LED arrays and standard laboratory imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of pre-treatment and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to various postmitotic tissues but may require optimization for tissue thickness or autofluorescence burden.
- Photobleaching duration may vary based on lamp intensity and tissue properties, requiring empirical adjustment.
