Name: 荧光显微镜下福尔马林固定人脑组织背景荧光的简单消除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 31 s
Description: 了解如何使用商用LED台灯对人脑组织进行光漂白处理，以消除免疫荧光显微镜中的背景自发荧光。该方法成本低廉，无需引入外源化合物，可显著提高成像清晰度。

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本研究由加拿大神经退行性疾病与老龄化联盟（CCNA）、加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大肌萎缩侧索硬化症协会（ALS Canada）以及加拿大阿尔茨海默病协会（ASC）全部或部分资助。作者谨此感谢来自大西洋地区脑组织库的 Sultan Darvesh 和 Andrew Reid 提供 FTLD 脑组织样本，感谢来自时空靶向与辐射反应放大（STTARR）项目及其相关资助机构的 Milan Ganguly 提供组织包埋与切片服务，并感谢先进光学显微镜设施（AOMF）提供显微镜设备。同时感谢 Kevin Hadley 对稿件的审阅与宝贵意见。

注意：本研究所进行的工作均符合公认的国际标准，包括国际人用药品注册技术协调会（ICH）、国际医学科学组织理事会（CIOMS）以及《赫尔辛基宣言》的原则。使用人体组织已获得大学健康网络研究伦理委员会的批准。人脑样本作为大西洋地区脑组织库的一部分进行收集。在样本采集时，已从所有患者处获得知情同意。
1. 光漂白装置的构建与溶液配制
<ol>
	<li>配制储备液。
	<ol>
		<li>通过将8.77 g NaCl和6.06 g Tris碱溶解于800 mL去离子水（ddH2O）中，配制1 L的1×储存液Tris缓冲盐水（1× TBS）溶液（150 mM NaCl，50 mM Tris-Cl，pH 7.4），用HCl调节pH至7.4。定容至1 L后进行高压灭菌。</li>
		<li>通过将1 g叠氮化钠溶解于10 mL去离子水（ddH2O）中，配制10%（200×储存液）的叠氮化钠溶液（10%，200×储存液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于1–3张标准尺寸的载玻片，使用一个100 mm × 100 mm透明方形培养皿作为载片室。对于单个载片室，将0.25 mL的200×叠氮化钠储存液加入50 mL的1× TBS中，配制成含0.05%叠氮化钠的TBS溶液（azide-TBS）。若需处理更多载玻片，可将2–3个载片室垂直堆叠。每个载片室额外准备50 mL azide-TBS溶液。</li>
	<li>制作支架，用于抬高载片室，以便灯头可置于其下方。
	<ol>
		<li>对于100 mm × 100 mm的载片室，裁剪一个100 mm × 100 mm × 30 mm塑料食品盒的底部和侧面，形成开口，并将该盒倒置。确保侧面开口足够大以容纳LED光源，底部开口足够大，使光源发出的光可无障碍地照射到样品室。</li>
		<li>在支架表面缠绕电工胶带，以增加支架与载片室或实验台之间的摩擦力。可使用其他替代材料构建支架，只要能稳固抬高载片室且不阻碍光线照射样品即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除台灯上可能阻碍LED光直接照射样品的扩散器或不透明塑料（如可行），并将LED阵列朝上放置。将支架及载片室置于LED阵列上方。建议使用带有柔性灯颈的台灯，以便于调节位置。</li>
	<li>通过用铝箔包裹一个足够覆盖载片室和支架的盒子内壁，为装置制作一个反光穹顶盖。单个载片室可使用1 mL移液器吸头盒，多个垂直堆叠的载片室则使用150 mm × 150 mm × 150 mm的纸板箱。</li>
</ol>
2. 组织切片的光漂白预处理
注意：组织切片的制备可能因组织来源以及所使用的固定和包埋方法不同而有所差异。本实验中，额颞叶变性-T（FTLD-T）病例的脑组织（眶额回）经福尔马林固定约2天，随后进行蔗糖梯度脱水，OCT包埋，并使用冷冻切片机切成10 µm厚的切片。
<ol>
	<li>在4 ºC的冷室、冷柜或冰箱中，将灯置于支架下方，并将样品室放置在支架上。向样品室中加入50 mL叠氮化物-TBS溶液。</li>
	<li>使用洁净的镊子将固定在标准玻璃显微镜载玻片上的组织切片浸入含有叠氮化物-TBS的切片盒中。若处理多个载玻片，需确保载玻片在盒内呈单层放置。</li>
	<li>用反射罩盖住装置，打开LED灯，并在4 ºC下孵育48小时。</li>
</ol>
3. 免疫荧光
<ol>
	<li>使用 DAPI 复染以及 Alexa 488 和 Texas Red 标记的二抗对组织进行磷酸化 tau 蛋白染色时，首先配制抗原修复、通透、封闭和一抗结合所需的溶液。
	<ol>
		<li>通过将 0.92 g 柠檬酸和 0.37 g 乙二胺四乙酸（EDTA）溶解于 500 mL 去离子水（ddH2O）中，配制 500 mL 抗原修复缓冲液（10 mM 柠檬酸，2 mM 乙二胺四乙酸，0.05% Tween 20；pH 6.2）。用 NaOH 调节 pH 至 6.2，并加入 0.25 mL Tween 20。</li>
		<li>向 500 mL 1× TBS 中加入 0.125 mL Triton X-100，配制 500 mL 含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液（TBS-Triton）。</li>
		<li>将 0.1 g 牛血清白蛋白（BSA）溶解于 10 mL TBS 中，配制 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS 溶液（BSA-TBS 缓冲液）。</li>
		<li>向 1.8 mL 1% BSA/TBS 溶液中加入 0.2 mL 正常山羊血清，配制封闭液。</li>
		<li>对于每张切片，通过移液枪吸取 1.5 µL 抗磷酸化 PHF-tau pSer202 + Thr205（AT8）抗体加入 148.5 µL 1% BSA-TBS 缓冲液中，配制 150 µL 一抗溶液（1:100 稀释），置于冰上备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行抗原修复时，将光漂白后的切片垂直浸入含有 25 mL 抗原修复缓冲液的切片架中。用胶带或绳子固定切片架，防止其落入水浴锅中。将切片架置于 90 ºC 水浴中加热 30 分钟，随后在室温下冷却 30 分钟后再取出切片。切勿立即取出切片，以免组织切片干燥。</li>
	<li>将切片从抗原修复切片架转移至装有 30 mL TBS-Triton 的染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS-Triton 后重复洗涤一次。用无绒纸巾吸去多余缓冲液，并用疏水笔圈出组织区域。注意避免切片干燥。
	<ol>
		<li>对于每张切片，向组织上滴加 200 µL 封闭液进行封闭，然后将切片放入湿盒中。通过将切片架置于含有湿润纸巾的移液枪头盒内构建湿盒。在水平台面上室温孵育 2 小时。确保封闭液完全覆盖组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用抽吸法去除封闭液，向组织上滴加 100–150 µL 一抗溶液。确保抗体体积充足，并将切片置于水平面上，以避免抗体溶液向一侧聚集。在湿盒中 4 ºC 过夜孵育。</li>
	<li>配制二抗混合液和 DAPI 核复染液。
	<ol>
		<li>对于每张切片，向 147 µL BSA-TBS 中加入 1.5 µL 山羊抗小鼠 Alexa 488 和 1.5 µL 山羊抗小鼠 Texas Red，配制 150 µL 二抗混合液（1:100 稀释），置于冰上备用。</li>
		<li>通过系列稀释配制 0.1 µg/mL DAPI 复染液。充分混匀储备液，取 1 µL 5 mg/mL DAPI 储备液加入 999 µL TBS 中，配制成 1 mL 5 µg/mL 溶液。对于每张切片，取 3 µL 5 µg/mL 溶液与 147 µL TBS 混合，终浓度为 0.1 µg/mL。 
		注意：DAPI 为已知诱变剂，操作时应谨慎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用抽吸法去除一抗，将切片浸入装有 30 mL TBS-Triton 的玻璃染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS-Triton 后重复洗涤一次。吸去多余 TBS-Triton，向每张切片滴加 100 至 150 µL 二抗混合液。
	<ol>
		<li>确保组织被抗体混合液完全覆盖。在湿盒中避光、室温孵育 2 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用抽吸法去除二抗混合液，将切片转移至装有 30 mL TBS（不含 Triton）的玻璃染色缸中，在旋转摇床上以轻柔振荡方式洗涤 5 分钟。更换新鲜 TBS 后重复洗涤一次。向每张切片滴加 100 至 150 µL 0.1 µg/mL DAPI 复染液，避光、室温孵育 10 分钟。</li>
	<li>将切片转移至装有 TBS 的玻璃染色缸中，每次用新鲜 TBS 洗涤 5 分钟，共洗涤 3 次，每次均轻柔振荡。吸去多余缓冲液。</li>
	<li>向组织上滴加 3 滴水溶性封片剂。用镊子夹取洁净的玻璃盖玻片，从一侧边缘开始，缓慢放下另一侧，以避免产生气泡。若需立即成像，请注意勿移动盖玻片。否则，应在暗处 4 ºC 保存前让封片剂自然干燥。</li>
</ol>
4. 荧光显微镜
<ol>
	<li>打开荧光灯、显微镜和计算机，让灯预热15分钟。将染色的组织切片放置在荧光显微镜载物台上。使用明场图像在10倍放大倍数下定位组织。</li>
	<li>在盖玻片表面滴加一滴ddH2O，使用20倍水浸物镜（NA=1.0）。选择四线平均平面扫描模式。将针孔大小设置为1个艾里单位，以获得约3微米的光学切片。为每种荧光染料在独立的通道中选择相应的激光激发和发射波长，以获得最佳信号。 
	注意：Alexa 488：λex = 488 nm（氩离子激光器），λem = 493–570 nm；Texas Red：λex = 561 nm（DPSS 561 nm激光器），λem = 601–635 nm；DAPI：λex = 405 nm（二极管405 nm激光器），λem = 410–507 nm。
	<ol>
		<li>调节激光功率和增益设置，以优化每个通道的信号强度。采集复合图像并保存。使用相同的激光设置来比较不同切片中的荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为了可视化各通道中的荧光强度，请为ImageJ安装RGB轮廓工具宏10。将网页上的宏保存为文本文件（https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt）。在ImageJ菜单中，选择插件 -&#62; 宏 -&#62; 安装；选择该文本文件以安装RGB轮廓工具。
	<ol>
		<li>在ImageJ中打开共聚焦图像文件，并通过以下步骤将来自三个图层的复合图像转换为RGB格式：图像 -&#62; 颜色 -&#62; 通道工具。从下拉菜单中选择&#34;复合图像&#34;，并勾选所有三个通道。然后选择图像 -&#62; 类型 -&#62; RGB颜色。</li>
		<li>&#160;选择RGB轮廓工具图标，在图像中需要分析的区域上画一条线。将强度数据保存为电子表格以便作图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+basement+membrane+collagen+and+elastin+in+the+autofluorescence+spectra+of+the+colon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig+Med%22%5BJournal%5D)">Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon.</a> J Investig Med. 47 (6), 326-332 (1999).</li>
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<li>Del Castillo, P., Llorente, A. R., Stockert, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+fixation%2C+exciting+light+and+section+thickness+on+the+primary+fluorescence+of+samples+for+microfluorometric+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Appl+Histochem%22%5BJournal%5D)">Influence of fixation, exciting light and section thickness on the primary fluorescence of samples for microfluorometric analysis.</a> Basic Appl Histochem. 33 (3), 251-257 (1989).</li>
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<li>Sun, Y., Chakrabartty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective+elimination+of+lipofuscin+fluorescence+from+formalin-fixed+brain+tissue+by+white+phosphor+light+emitting+diode+array%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cost-effective elimination of lipofuscin fluorescence from formalin-fixed brain tissue by white phosphor light emitting diode array.</a> Biochem Cell Biol. 94 (6), 545-550 (2016).</li>
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<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Robertson, J. B., Zhang, Y., Johnson, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-emitting+diode+flashlights+as+effective+and+inexpensive+light+sources+for+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Light-emitting diode flashlights as effective and inexpensive light sources for fluorescence microscopy.</a> J Microsc. 236 (1), 1-4 (2009).</li>
<li>Mackenzie, I. R. A., Neumann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+neuropathology+of+frontotemporal+dementia%3A+insights+into+disease+mechanisms+from+postmortem+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Molecular neuropathology of frontotemporal dementia: insights into disease mechanisms from postmortem studies.</a> J Neurochem. 138 (S1), 54-70 (2016).</li>
<li>Kouri, N., Whitwell, J. L., Josephs, K. A., Rademakers, R., Dickson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corticobasal+degeneration%3A+a+pathologically+distinct+4R+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Corticobasal degeneration: a pathologically distinct 4R tauopathy.</a> Nat Rev Neurol. 7 (5), 263-272 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的组织光漂白预处理方法可利用现成组件有效消除自发荧光。该方案描述了使用偶联Alexa 488和Texas Red的二抗，以及DAPI作为细胞核复染剂，对福尔马林固定的人脑组织中磷酸化tau蛋白聚集体进行免疫荧光成像。若将该方法应用于其他组织，我们建议以48小时的光漂白预处理作为起始条件。光漂白后，按照制造商推荐的抗体稀释比例，对目标结构执行标准的免疫荧光染色流程。如果背景荧光仍然存在，则需要调整光漂白时间或抗体染色步骤。光漂白的持续时间将根据所选光源装置及样品中自发荧光的水平而有所不同，每种独特的光源装置均需确定其最佳漂白时间。可通过将未染色、封片并置于TBS-叠氮化钠中的组织切片进行光漂白，并在荧光显微镜下每隔12小时测量切片的内源性荧光来实现优化。在以往的研究中，我们通过颗粒分析和指数衰减函数拟合来监测脂褐素的光漂白过程5，但为简便起见，定期肉眼观察切片也可有效判断大部分荧光被淬灭所需的时间。以富含大量脂褐素色素的老化脑组织为例，使用800 lux光源照射48小时已足够充分。若光漂白后特异性信号仍较弱，可考虑在染色过程中提高一抗和二抗的浓度。同时，进行仅使用二抗的对照实验至关重...

利用靶向特定蛋白质的抗体进行荧光显微成像，是细胞培养和组织中可视化目标蛋白的常规方法。免疫荧光成像中获得清晰明确图像的主要障碍之一是自发荧光（autofluorescence），其可由哺乳动物组织内源性因素引起，例如衰老色素脂褐素（lipofuscin）以及弹性蛋白（elastin）和胶原蛋白（collagen）1,2。其他自发荧光来源可能来自样本制备过程中的步骤，例如醛类固定3。脂褐素颗粒主要由氧化修饰的蛋白质和脂质降解残基组成，会随着年龄增长而在长寿命细胞中逐渐积累2。这给终末分化组织（如脑组织以及心肌或骨骼肌）的成像带来困难，因为脂褐素的荧光发射光谱宽且多变，常与常用于标记的荧光染料的发射波长重叠4。这些因素使得晚发性神经退行性疾病（如额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD））患者脑组织的人类样本成像尤为具有挑战性。
为了降低自发荧光，我们设计了一种技术，使用家用台灯中的白色发光二极管（LED）阵列照射载玻片上的组织切片5。这种简单的方法可替代使用化学淬灭剂（如醋酸铵中的CuSO4）或市售淬灭染料（如苏丹黑B和偶氮黑T）的技术6。此外，该方法相比多光谱LED灯的光漂白技术显著降低了成本，并避免了光谱解混等数字自发荧光去除方法所带来的复杂性和伪影7,8。白色磷光LED具有宽发射光谱、高亮度和低制造成本的优点，使其成为漂白多种发色团的理想现成组件5,9。
在本实验方案中，我们展示了如何使用易得的组件构建光漂白装置，并应用该装置对含有tau蛋白阳性包涵体的额颞叶变性组织（FTLD-T）进行光漂白处理，所用抗体特异性识别磷酸化tau蛋白。我们评估了光漂白对两种常用荧光染料Alexa 488和Texas Red标记的荧光抗体成像效果的影响。同时，定量比较了经光漂白处理的样本与未经处理样本或经商用化学淬灭剂处理样本之间的差异。这种光漂白预处理步骤可整合到任何标准的免疫荧光染色流程中，以去除生物样本中的自发荧光。

<table><tbody><tr><td>Trizma 碱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Caledon 实验室化学品公司</td><td>1506656</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>BioShop 加拿大公司</td><td>SAZ001</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 100 mm × 20 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.9923.422</td><td>光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换</td></tr><tr><td>6 W 可调光 LED 台灯</td><td>DBPower</td><td>DS501</td><td>光漂白装置的所有组件可根据可获得性进行替换</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2404</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸&amp;nbsp;(EDTA)</td><td>BioShop 加拿大公司</td><td>EDT001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7949</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>BioShop 加拿大公司</td><td>SHY700.1</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Haake Fisons</td><td>K15</td><td></td></tr><tr><td>载玻片架</td><td>FisherScientific</td><td>12-587-17B</td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td>FisherScientific</td><td>E94</td><td></td></tr><tr><td>旋转摇床</td><td>Bellco 玻璃公司</td><td>&amp;nbsp;7744-08115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7878</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>FisherScientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Aurion</td><td>905.002</td><td></td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z672548-1EA</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化 Tau 蛋白单克隆抗体（Ser202, Thr205）(AT8)</td><td>ThermoFisher</td><td>MN1020</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗，Texas Red-X</td><td>ThermoFisher</td><td>T862</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗，Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>ThermoScientific</td><td>28-600-42</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>成像软件 ZEN 2012 黑色版 11.0</td><td>Zeiss</td><td>LSM710</td><td>软件随共聚焦显微镜提供</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>RGB 配置文件工具宏</td><td>NIH</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt</td></tr><tr><td>商用化学淬灭剂</td><td>Biotum</td><td>23007</td><td></td></tr></tbody></table>

简单去除福尔马林固定人脑组织中背景荧光以进行免疫荧光显微镜检测

Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy

免疫荧光是一种常用的方法，用于观察亚细胞结构并确定特定蛋白质在组织样本中的定位。获得高质量免疫荧光图像的一个主要障碍是组织自身的内源性自发荧光，这种自发荧光可能由衰老相关色素（如脂褐素）引起，也可能源于常见的样本制备过程（例如醛类固定）。本方案描述了一种在使用荧光探针前，利用白色磷光体发光二极管（LED）阵列进行光漂白以显著降低背景荧光的方法。白色磷光体LED的宽谱发射特性可实现对多种发射峰范围内的荧光分子进行漂白。该光漂白装置可由市售组件以极低成本组装而成，为商业化的化学淬灭剂提供了一种经济且易于获取的替代方案。在组织样本进行光漂白预处理后再实施常规免疫荧光染色，可获得无背景自发荧光干扰的图像。与已有的化学淬灭剂（会同时降低探针信号和背景信号）相比，光漂白处理在有效减少背景荧光和脂褐素荧光的同时，对探针荧光强度无任何影响。尽管光漂白预处理所需时间较长，但可通过使用更高强度的LED阵列来缩短处理时间。这一简单方法有望应用于多种组织，特别是易于积累脂褐素的终末分化组织，如脑组织以及心肌或骨骼肌。

在抗原修复和免疫染色之前，可将光漂白预处理步骤加入标准的免疫荧光实验流程（图1A）。光漂白装置的组装也可使用多种价格低廉、市售可得的组件完成（图1B）。白色磷光LED的发射光谱覆盖了较宽的波长范围，因此适用于广谱光漂白，这与先前报道的结果一致（图1C）5,11。在对FTLD-T未染色切片进行48小时光漂白后，模拟脂褐素的自发荧光颗粒以及整体背景荧光在两个发射波长下的强度均显著降低（图1D）。为验证光漂白的效果，我们采用两种不同的二抗对FTLD-T病例中的病理性tau蛋白包涵体进行高磷酸化tau染色。tau包涵体的明确形态以及两种发色团的联合标记有助于我们可靠地区分自发荧光特征与目标信号，从而验证该技术的有效性。
...

生物样本的背景自发荧光常常使基于荧光的成像技术复杂化，尤其是在老年个体的终末分化组织中尤为明显。本方案描述了如何利用市售的发光二极管光源，在免疫染色前对样本进行光漂白，从而有效去除这些样本中的自发荧光。

免疫荧光是一种常用方法，用于观察亚细胞结构以及确定特定蛋白质在组织中的定位……

免疫荧光显微镜中常见的问题是内源性背景荧光的存在，这可能会干扰您的信号。在许多情况下，这种自发荧光会使实验结果无法解读。在本方案中，我们将演示如何使用商用LED台灯通过光漂白去除人脑组织样本中的自发荧光。该方法的主要优势在于与现有技术相比可显著降低成本，同时不牺牲效果，并且不会向样品中引入任何外源性化合物。实验开始前，需配制1倍浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）和10%叠氮化钠的储备液。每处理三张标准尺寸的显微镜载玻片，需要准备一个100毫米×100毫米的方形培养皿作为载玻片孵育室。每个载玻片腔室，通过将25毫升10%叠氮化钠加入50毫升1倍TBS中，配制50毫升0.5%叠氮化钠TBS溶液。搭建一个支架，将载玻片腔室抬高，以便灯头可以置于其下方。对于100毫米方形培养皿，可将大小相似的塑料食品盒裁剪成合适形状作为支架。任何能够稳固抬升载玻片腔室且不妨碍光线到达样品的装置均可使用。准备一个白光磷光体LED台灯，并移除覆盖光源的任何扩散片或不透明塑料。将LED阵列朝上放置。为此目的，建议使用带有柔性颈部的灯。通过用铝箔覆盖足够大以容纳载玻片腔室和支架的盒子内部，为装置构建一个反光穹顶罩。对于单个腔室，可使用一个一毫升移液器吸头盒。本视频中，采用福尔马林固定的额颞叶变性-T型（FTLD-T）人脑眶额回脑组织进行光漂白预处理。组织切片的制备及氨基染色步骤可能因组织来源、固定方式及包埋方法的不同而有所调整。在4°C的低温室、低温柜或冰箱中，将光源置于支架下方，样本室放置于支架上方。用 50 毫升叠氮化物 TBS 填充样品室。使用洁净的镊子将贴附于标准玻璃载玻片上的 10 微米厚组织切片浸入样品室中。用反射穹顶盖住装置，并打开 LED 灯。让样本光漂白48小时。该孵育时间可能因光源强度和组织中自发荧光物质的含量不同而有所变化。完成光漂白预处理后，可按照针对特定组织和目标蛋白的标准方案对切片进行免疫染色。为演示目的，使用与 Alexa 488 和 Texas Red 偶联的二抗对 FTLD-T 脑组织进行磷酸化 tau 蛋白染色。DAPI 用作细胞核复染剂。配制 500 毫升抗原修复缓冲液、500 毫升含 0.025% Triton X-100 的 TBS 溶液、10 毫升含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS 溶液，以及 2 毫升封闭液，封闭液由羊血清加入 BSA TBS 溶液中配制而成。将光漂白的切片浸入切片盒中的抗原修复缓冲液内进行抗原修复。将切片盒在90摄氏度下加热30分钟。切片盒从加热处理中取出后，必须在室温下冷却30分钟。立即移除载玻片将导致切片干燥。根据制造商的建议配制一抗混合液。本实验中，抗磷酸化PHF tau p-丝氨酸202和苏氨酸205（AT8抗体）以BSA-TBS缓冲液按1:100稀释后置于冰上备用。每张切片需要150微升抗体混合液。切片冷却30分钟后，将载玻片从抗原修复容器转移至盛有TBS-Triton的染色缸中，在轻度振荡条件下洗涤5分钟。更换并替换 TBS-Triton 溶液，重复此洗涤步骤一次。洗涤完成后，将载玻片从染色缸中取出，用吸水纸吸去多余的缓冲液。使用疏水性笔在组织周围画出轮廓线。这可以防止溶液从载玻片上流失。注意不要让载玻片干燥。用移液器将 200 µL 封闭液加到载玻片上以封闭组织，并将载玻片置于湿化 chamber 内。该孵育室可以简单到只是一个装有湿润纸巾的移液器吸头盒内的载玻片架。确保整个组织样本均被封闭液覆盖。室温孵育两小时。用移液器或抽吸装置移除封闭液。向切片上加入100至150微升的一抗混合液。确保整个样本均被抗体溶液覆盖，并将切片置于水平面上，以避免抗体溶液分布不均。在湿盒中，4摄氏度下与一抗孵育过夜。次日，配制二抗混合液。本实验中，使用BSA-TBS将山羊抗小鼠Alexa 488和山羊抗小鼠Texas Red按1:100稀释。取出组织切片，用移液器或抽吸装置去除一抗溶液。使用盛有TBS Triton的染色缸，以与之前相同的方式洗涤两次，每次洗涤5分钟。洗涤后，用吸水纸吸去多余的缓冲液。用移液器加入100至150微升二抗溶液，确保组织样本再次被完全覆盖。在湿盒中室温避光孵育两小时。根据制造商说明或系列稀释法，用TBS配制0.1微克/毫升的DAPI复染液。务必充分混匀 DAPI 储存液，以防出现不溶现象。取出载玻片并移除二抗混合液。用普通 TBS 洗涤样本两次，而非使用含 Triton 的 TBS。吸去或用移液器移除残留的洗涤液，然后向组织切片上滴加100至150微升DAPI染液。室温避光孵育10分钟。取出样本，用不含添加剂的TBS洗涤三次，而非两次。洗涤后，小心移除残留的洗涤液。加入封片剂，并用盖玻片覆盖样本，完成载玻片封片。使用镊子将盖玻片的一边先放下，再缓慢降低对侧边缘，以避免产生气泡。让封片剂干燥后，于4°C避光保存。载玻片现已准备好用于观察。荧光显微镜的设置将根据所使用的荧光染料和显微镜型号而有所不同。打开荧光灯、显微镜和计算机，让光源预热15分钟。将染色的组织切片放置在荧光显微镜下。使用明场在10倍放大倍数下定位组织。找到合适的组织区域后，在样品的盖玻片上滴加一滴水。切换至20倍水浸物镜。为获得最佳信号，应针对每种荧光染料在独立的通道中选择合适的激光激发波长和发射波长。相关设置及所用波长的更多细节请参见随附的论文。调整激光功率和增益设置，以优化每个通道的信号强度。找到合适的设置和视野后，保存包含各通道荧光数据的复合图像。为了可视化各通道的荧光强度，请为 ImageJ 安装 RGB Profile Tools 宏。在 ImageJ 中打开 lsm 共聚焦图像文件，并通过选择图像 → 颜色 → 通道工具，将来自三个图层的复合图像转换为 RGB 模式。选择复合图像并勾选所有三个通道。接着转到图像、类型和RGB颜色。选择RGB配置文件工具图标，并在需要分析的图像区域上画一条线。在本视频中，已介绍了对组织样本进行光漂白预处理以产生背景荧光的步骤。该操作可在抗原修复和氨基染色之前的任何标准氨基荧光实验流程中加入。用于光漂白的装置价格低廉且易于获取，由市售组件构成。白光磷光LED在较宽的波长范围内发射光线，因此非常适用于广谱漂白。使用一种常见的LED台灯，对未经染色的人类FTLD-T脑组织样本进行光漂白，并采用适用于Texas Red和Alexa 488染色样本的波长进行成像。未经处理的样本显示出大量自发荧光。相比之下，光漂白导致类似脂褐素的自发荧光颗粒以及总体背景荧光的强度显著降低。为了进一步验证该技术，对额颞叶变性-T型（FTLD-T）脑组织样本进行了染色，以检测过度磷酸化的tau蛋白——这种蛋白在该疾病中会发生错误折叠，并以独特的包涵体形式积聚。使用两种不同的二抗，以更好地区分tau蛋白标记与非特异性荧光。在这些复合图像中，Alexa 488 与 Texas Red 的共定位显示为黄色，代表正确染色的 tau 蛋白。红色或绿色区域的出现表明存在非特异性荧光或其中一种发色团的淬灭现象。在未经处理的对照样本中，可观察到明显的背景信号和非特异性信号，尤其是在 Texas Red 通道中。光漂白预处理以及化学淬灭剂的应用均可显著降低背景信号。如果我们将荧光通道分开，并在更高放大倍数下观察图像，则可获得更详细的观察结果。未经处理的对照样本在所有通道中均存在背景荧光，以及非特异性信号，主要出现在Texas Red通道中，其强度与tau蛋白特异性标记信号相似。如果tau包涵体没有明确且可预测的形态特征，这些Texas Red结果可能会因存在自发荧光结构而被误读。光漂白预处理可完全消除这些Texas Red非特异性信号，同时保留大部分tau特异性的Texas Red和Alexa 488信号。然而，光漂白似乎对DAPI背景荧光影响甚微。化学淬灭剂在降低Alexa 488通道背景荧光方面与光漂白效果相当。然而，它同时也降低了DAPI和Texas Red的荧光强度，提示存在一定的非特异性淬灭作用。这些效应的定量结果可通过信号轮廓图观察。如您所见，该方法可产生无干扰特征的清晰图像。这种光漂白预处理可整合到任何标准的氨基荧光实验流程中，以消除自发荧光，获得高质量且明确的结果。

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